如何深入挖掘单基因分子机制发4分+纯生信文章?

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大家好,这次给大家分享的文献是microRNA-Dependent Modulation of Genes Contributes to ESR1's Effect on ERα Positive Breast Cancer,2020年5月发表在Front Oncol杂志上,影响因子4.848。文章重点研究ESR1基因在ERα阳性乳腺癌中的分子机制,着重使用了网络分析来构建分子调控机制!

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研究流程图

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结果

1.筛选Luminal a型乳腺癌 and Luminal B型乳腺癌的DE-miRNAs和DE-mRNAs

为了研究ERα阳性乳腺癌中ESR1介导的miRNA分子调控机制,本文选取了GSE38280数据集中包含的4例Luminal a型和Luminal B型乳腺癌数据作为研究对象。首先,测定乳腺癌标本中ESR1的表达水平(图1A、B)。与4例Luminal B型乳腺癌患者相比,4例Luminal a型乳腺癌患者的ESR1表达明显上调。同时检测ESR2的表达(图1C),两组之间无显著差异。此外,在乳腺癌分子亚型分类中另外三个关键分子(PGR、ERBB2和MKI67)的表达值分别如图1D-F所示。接下来,使用数据集GSE38280的miRNAs子数据集GSE38278,利用在线工具GEO2R识别luminal A和luminal B乳腺癌之间的DE-miRNAs,共获得74个显著的DE-miRNAs,包括19个上调的DE-miRNAs和55个下调的DE-miRNAs(图1G)。随后,对数据集GSE38280的mRNA亚数据集GSE38279进行差异表达分析,进一步筛选了Luminal a型和Luminal B型乳腺癌的DE-mRNAs(图1H),最终获得359个显著上调的DE-mRNAs和471个显著下调的DE-mRNAs。通过miRNet数据库,预测了74个DE-miRNAs的潜在靶基因。最终预测这些DE-miRNAs共有8855个靶点。为了确定候选的DE-mRNAs,作者将这些靶基因和显著的DE-mRNAs取交集。312个DE-mRNAs用作后续分析(图1I)。

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图1

2. 功能注释、通路富集和蛋白质相互作用(PPI)分析

为了更好地了解这些候选DE-mRNAs基因,作者首先利用Enrichr数据库进行GO(图2A-C)和KEGG(图2D)富集分析。接下来,将这些候选的DE mRNAs映射到STRING数据库中进行PPI分析。利用Cytoscape软件(3.6.1版)根据节点度来识别PPI网络中的hub基因。如表2所示,筛选出节点度≥10的前51个hub基因。为了更好的可视化,作者重新构建了前51个hub基因的亚PPI网络(图2E)。选择这些hub基因进行后续分析。

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图2

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3. ERα阳性乳腺癌Hub基因的生存分析
接下来,作者使用Kaplan-Meier绘图仪数据库评估了51个hub基因在ERα阳性乳腺癌中的预后价值。如图3所示,51个hub基因中的27个在ERα阳性乳腺癌中具有显著的预后作用,说明27个hub基因可能是调节ERα阳性乳腺癌的关键基因。
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图3

4. 鉴定ERα阳性乳腺癌中一个潜在的miRNA网络

从ERα阳性乳腺癌中筛选出27个具有显著预后价值的hub基因,构建miRNA-mRNA网络。这27个hub基因在luminal B型乳腺癌中显著上调。基于miRNAs对下游靶基因的负调控机制,27个hub基因的上游miRNA在luminal B型乳腺癌中应表达下调。在所有潜在的27个miRNAs中,26个miRNA的表达水平在luminal B型乳腺癌显著降低。STRING+Cytoscape得到的26个miRNA 的72个miRNA-mRNA关系对的可视化网络图如图4所示。

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图4

5.ERα阳性乳腺癌候选miRNA的生存分析

基于TCGA和METABRIC数据库,利用Kaplan-Meier绘图仪确定了26个miRNA在ERα阳性乳腺癌中的预后作用(图5A、B)。通过结合TCGA和METABRIC数据库中有良好预后的miRNA,取二者交集(图5C)。在TCGA和METABRIC数据库中出现了7个对ERα阳性乳腺癌具有良好预后作用的miRNA。hsa-let-7a5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR10b-5p、hsa-miR-195-5p和hsa-miR-497-5p的生存曲线如图5D-J所示。选择7个miRNAs及其相应的下游靶向hub基因进行接下来的分析。

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图5

6. ERα阳性乳腺癌ESR1介导miRNA调控网络的建立

随后,作者对ESR1与7个miRNA之间进行了相关性分析。在ERα阳性乳腺癌中,ESR1的表达与hsa-let-7a-5p(图6A)、hsa-let7c-5p(图6B)、hsa-miR-30a-5p(图6C)、hsa-miR-29c3p(图6D)、hsa-miR-10b-5p(图6E)、hsa-miR-195-5p(图6F)和hsa-miR-497-5p(图6G)呈正相关。接下来,作者想确定ESR1是否是7个潜在miRNAs的上游调节因子。这里选择MCF-7和T47D作为ERα高表达的两个具有代表性的细胞系。在MCF-7和T47D细胞中使用ESR1 siRNA后,ESR1表达显著下调(图6H)。正如预期的那样,在MCF-7(图6I)和T47D(图6J)中ESR1基因敲除后,7个潜在miRNA的表达水平显著降低。紧接着作者评估了ERα阳性乳腺癌中7个潜在miRNA及其靶点的表达关系(图7A-I)。此外,作者还确定了ERα阳性乳腺癌中miRNAs和靶hub基因的上下游关联。在MCF-7和T47D细胞中首次检测到miRNA模拟物的过度表达效应。如图7J,K所示,分别使用MCF-7和T47D中的miRNA模拟物显著上调了7个miRNA。除了hsa-let-7a-5p-CCNB2和hsa-miR-30a-5p-MYBL2对外,在MCF-7(图7L)和T47D(图7M)中过度表达7个miRNAs后,这7个miRNAs的潜在靶向hub基因的表达水平显著下调。考虑到所有这些发现,构建了ESR1介导的miRNA调控网络,如图8所示。最后,18个ERα阳性乳腺癌组织被用来验证ESR1 -miRNA、miRNA-mRNA和ESR1- mRNA对之间的关系(图9)。在ERα阳性乳腺癌中,ESR1表达与miRNA表达呈正相关,miRNA表达与mRNA表达呈负相关,ESR1表达与mRNA表达呈负相关。在这些配对中,只有hsa-miR-497-5p/CCNE1对没有统计意义(图9M),这也进一步支持了之前的生物信息学分析。

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图6

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图7

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图8

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图9

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结语

ERα阳性乳腺癌的内分泌治疗耐药性和转移是ESR1失调的原因。因此,本文重点研究了ESR1基因在ERα阳性乳腺癌中的分子调节机制,所用到的方法主要是网络分析(STRING+Cytoscape)。想研究单基因在某种癌症中作用机制的朋友可以借鉴一下这篇文章!


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