热性中药附子调节机体内源性代谢产物的分子作用机制研究

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 要:目的  采用代谢组学技术观察附子Aconiti LateralisRadix Praeparata对小鼠血清内源性代谢物的影响,寻找其相关生物标志物和可能表征附子临床治疗作用的代谢途径及相关靶点,探讨其发挥疗效的分子机制。方法  20只雄性小鼠随机分为2组,分别ig附子水煎液和蒸馏水,小鼠给药量为15 mL/(kg∙d),连续ig 4 d;采集各组血样,利用UPLC-MS/MS技术进行分析,主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等分析方法进行数据模式识别,并根据变异权重系数(VIP)大于1和手动积分计算筛选出差异代谢物;利用差异代谢物进行通路分析;运用CytoscapeMetScape对差异代谢物进行网络模块化分析并筛选靶标。结果  通过数据模式识别,附子组与对照组均能完全分离;共筛选出18个差异代谢物,其含量都呈上调趋势;通过通路分析,得出5条相关通路,分别为亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、烟酸和烟酰胺代谢和磷酸肌醇代谢通路;网络模块化分析共得到14个模块,其中最大的2个模块是花生四烯酸代谢通路和亚油酸代谢通路;在整个网络中,花生四烯酸(59)、亚油酸(55)、烟酰胺(26)和棕榈酸(11)节点度值大于均值(8.010),涉及的通路分别为花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢和饱和脂肪酸β-氧化通路;共筛选出26个相关基因,同属于细胞色素P450CYP450)酶系。结论 附子可能通过作用于CYP450,影响花生四烯酸代谢等途径,进而调节机体能量代谢,从而发挥临床治疗作用。

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx的侧根,性热、味辛,首载于《神农本草经》,具有回阳、逐冷、祛风湿等作用,是临床常用中药,主要用于大汗亡阳、四肢厥逆、霍乱转筋、肾阳衰弱的腰膝冷痛、形寒爱冷、精神不振以及风寒湿痛、脚气等病症的治疗。近年的现代研究发现其对心血管疾病的治疗作用显著、疗效明确,但其确切的分子作用机制目前尚未得以揭示[1-2]代谢组学是从整体上对生物机体内代谢物的动态变化进行分析研究的现代生物学分析技术[3]与中药多组分、多靶点、多效应的作用特点和整合作用的治疗特征不谋而合,是研究中药对机体产生变化的重要现代化手段。本实验在以往对辛热中药药性、药效评价的基础上,利用UPLC-MS/MS组学技术分析典型的热性中药附子干预小鼠后的内源性血清代谢物变化,寻找可能表征附子性效相关的代谢途径及相关靶点,进而阐释其治疗心血管疾病可能的分子机制。

1  材料

1.1  药材

附子饮片购买于北京同仁堂,经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx. 子根的加工品,符合《中国药典》2015年版的相关规定。

1.2  仪器与试剂

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪(Themo Fisher公司);Thermo Q EXACTIVE质谱仪(Themo Fisher公司);C18色谱柱(100 mm×2.1 mm1.7 μmThermo Syncronis公司);BSA223S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);Milli-QAdvantageA10型超纯水仪(Millipore公司);电子天平(MettlerToledo 公司);DW-HL388−80 ℃超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司);BCD-320D11D型冰箱(信科龙电器股份有限公司);5402型冷冻离心机(Eppendorf公司);KQ-250 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);甲醇(色谱级,批号152469)、乙腈(色谱级,批号136376)、甲酸(色谱级,批号152469)、甲酸铵(色谱级,批号152469)均购于Themo Fisher公司;超纯水(屈臣氏集团)。

1.3  实验动物

雄性昆明小鼠20只,体质量为1822 g,购买于军事医学科学院。动物许可证号为SCXK-(军)2012-0004。实验小鼠适应性饲养7 d后进行正式实验。

1.4  数据库及软件

Metlin[4]数据库(http://metlin.scripps.edu/);HMDB[5]数据库(https://www.hmdb.ca);KEGG[6-7]数据库(https://www.genome.jp/kegg/ligand.html);Mzcloud数据库(https://www.mzcloud.org/);MetaboAnalyst 4.0[8]数据库(https://www. metaboanalyst.ca/);Cytoscape v 3.7.0[9]软件(https://www.cytoscape.org/);MetScape[10]插件(http://apps.cytoscape.org/apps/metscape);Trace Finder软件。

2  方法

2.1  中药制备

将小鼠用药剂量按照公式进行折算,然后用电子天平称取一定量的附子饮片后倒入烧杯中,加蒸馏水浸泡(用量为浓缩后药液的10倍量体积),时间为30 min。然后倒入锅中,进行煎煮。一煎:先用武火煮至锅中水沸腾,再用文火煎煮1.5h后,使用纱布滤过;二煎方法与一煎相同,煮沸后,文火煎煮0.5 h,合并2次煎液,再用文火浓缩至质量浓度为0.15 g/mL。附子为有毒中药,煎煮过程中加入适量开水,以保证其药效及减小毒副作用。

小鼠用药剂量=9.01×成人用药剂量

2.2  动物分组及给药

20只雄性小鼠进行随机分为2组,每组10只,分别为附子组和对照组,每组进行编号。连续ig给药4 d,小鼠给药量为15 mL/(kg∙d),对照组ig蒸馏水15 mL/(kg∙d)

2.3  血样采集与处理

小鼠给药结束后,进行眼球取血,采集其血样于1.5 mL EP管中。将采集到的血样4 ℃冰箱静置2 h,然后在4 ℃条件下,以12 000 r/min的速度离心10 min,离心后的血清在−80 ℃条件下冷冻保存。分析前,将冷冻的小鼠血清取出,室温解冻,从每个血清样品中取50 μL,加入沉淀剂甲醇-乙腈(11450 μL,涡旋30s,然后在4 ℃条件下,以12000 r/min的速度离心10 min,取其上清液,直接进样分析。

2.4  UPLC-MS/MS分析

2.4.1  色谱条件 色谱柱为ThermoSyncronis C18色谱柱(100 mm×2.1 mm1.7 μm),流动相组成为水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸铵,A-乙腈(B)。梯度洗脱,洗脱时间为035 min,进样量为5 μL,体积流量为0.3 mL/min。流动相梯度洗脱条件为:01.00 min95%A1.0025.00min95%5%A25.0030.00 min5%A30.0030.01 min5%95% A30.01~35.00 min95% A

2.4.2  质谱条件 采用ESI离子源正、负离子同时扫描模式;电喷雾电压为2 800 V;鞘气体积流量为10.5 L/min;辅助气体积流量为3 L/min;毛细管温度为320 ℃;一级全扫描分辨率为70 k,扫描范围m/z:501 000;二级数据依赖性扫描分辨率为17.5 kStepped NCE值分别为204060 V

2.5  数据分析

将上述所得的小鼠血清内源性代谢物的分子式和相对分子质量在Mzcloud数据库中进行鉴定,同时利用Trace Finder自行建立代谢物数据库进行识别。再利用MetlinHMDBKEGG等数据库进行检索并多次确认。在MetaboAnalyst 4.0中利用多种分析方法(PCAPLS-DA及高通量代谢通路分析)进行分析。最后在Cytoscape v 3.7.0中利用MetScape绘制代谢网络图进行模块化分析和靶点筛选。

3  结果

3.1  一般情况

在整个实验过程中,对照组小鼠状态、饮食、大小便及行为活动等均无明显变化。小鼠ig附子水煎液后,整体状态良好,毛发正常,和对照组相比,并无显著性变化。随着给药时间的延长,附子组小鼠水摄入量增加,大便质地变硬,尿液颜色发生变化,活动量增加。各组小鼠状态持续至给药结束。

3.2  代谢物鉴别方式

Mzcloud数据库中对小鼠血清内源性代谢物的分子式和相对分子质量进行鉴定识别,再利用多个数据库进行峰比对并多次确认。在正、负离子任意模式下,对应出峰时间,根据相应的离子碎片鉴别代谢物。如图1所示,以正离子模式下的缬氨酸为例确定内源性物质。图1-A中分别为正、负离子模式图,图1-B是正离子模式下缬氨酸的色谱峰,图1-C是正离子模式下缬氨酸所对应的离子碎片。

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3.3  2组小鼠血清比较分析

3.3.1  血清UPLC-MS/MS数据模式识别  附子组与对照组小鼠血清样品分别进行PCAPLS-DA分析方法对比分析,选择Pareto模式为其数据处理方法。如图2所示,对照组(K)用绿色表示,附子组(A)用红色表示。

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首先将对照组与附子组进行PCA分析,如图2-A2-B所示,可以看出,对照组和附子组样本分别有一定的聚集成群的趋势,并且2组样本能够较好地分离开来,说明在附子的干预下,小鼠体内代谢物发生了明显变化。利用PLS-DA分析方法对两组血清数据进行模式识别,如图2-C2-D所示,可见对照组和附子组在有监督的情况下聚集性更强,而且2组样本更能有效分离。3.3.2  差异代谢物筛选  经过“3.3.1”项中数据模式识别分析方法分析,可列出20(样本)×184(变量)的矩阵。采用PLS-DA分析,得到5种算法计算后的小鼠血清代谢物的变异权重系数(VIP)值表,筛选出5种算法下均满足VIP1的差异代谢物共有21个。将矩阵列为20(样本)×21(变量),再进行t检验手动积分进一步筛选。最终,确定附子组与对照组对比后18个变量可作为差异代谢物。结果见表12

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3.4  代谢通路分析

对以上分析方法筛选出的差异代谢物进行高通量代谢通路分析,结果如表3、图3所示,同一代谢通路中的全部代谢物数量用Total表示;差异代谢物在同一代谢通路中出现的个数用Hits表示;在通路分析中计算的原始P值用Rawp表示。Impact值大于0.10的代谢通路表示该通路可能与潜在的靶标路径紧密相关。根据分析结果,共得出5条相关通路,分别为亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、烟酸和烟酰胺代谢、磷酸肌醇代谢通路。

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3.5  代谢组学网络构建及分析

Cytoscape v 3.7.0软件中利用MetScape插件构建附子组与对照组比较得到的差异代谢物的相关代谢网络(图4)。在构建得到的代谢组学网络图中,总共可细分为14个相关网络模块,其中花生四烯酸代谢通路和亚油酸代谢通路是整个网络中最大的模块。在该网络图中,深色六边形表示代谢通路中本研究得到的差异代谢物,浅色六边形表示此通路中的其他代谢物,圆形代表相关靶点,边代表它们之前的相互关系。对此代谢组学网络进行拓扑分析,参数如表4所示。根据其拓扑参数可知该网络中每个基因或代谢物的直接邻居数均值为8.010,表明每个基因或代谢物的节点度均值为8.010。在整个网络中,差异代谢物节点度值大于均值的有4个,分别为花生四烯酸(59)、亚油酸(55)、烟酰胺(26)和棕榈酸(11)。节点度值越大,表明其对整个网络的影响越大[11]。以上4个差异代谢物在所构建的代谢通路中分别作用于花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、饱和脂肪酸β-氧化通路,且这4个通路模块在网络中占比也最大。其中花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢通路和“3.4”项中构建的代谢通路分析结果一致。

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3.6  靶点预测及分析

将代谢组学网络模块图中相关基因进行分析筛选,其中高于平均节点度的基因有26个(表5)。分析可知,这26个基因是网络图中最大两个模块的共有基因。在本研究中同时利用以下3种算法来衡量26个基因在整个网络中的重要性,分别为度中心性、接近中心性和中介中心性算法,如表6所示。从表中可知,26个基因3个中心性值都相等,表明其在整个网络中处于同等重要的地位。对这26个基因进行分析,可知它们同属于细胞色素P450CYP450)超家族。因此,附子可能是作用于CYP450从而引起小鼠体内代谢物的变化。

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4  讨论

本实验利用代谢组学技术对小鼠给药附子后其血清代谢物变化进行分析,根据PCAPLS-DA分析方法对小鼠血清数据模式识别,可以看到附子组能够与对照组完全分离,表明在附子的干预下,小鼠血清中代谢物的含量产生了显著变化。根据分析结果,尿素、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、花生四烯酸、葡萄糖、肌醇、烟酰胺等18个代谢物可作为小鼠给药附子后的生物标志物,且这些标志物在附子作用下,都呈显著上调趋势,这些标志物在机体蛋白质、糖类代谢或脂质代谢等代谢过程中发挥重要作用[12-14],表明附子通过上调小鼠机体内这些代谢物变化,进而引起机体能量代谢增强,与目前已报道的研究结果相符合[15-16],这可能与附子的温热药性相关。附子中含有生物碱类、多糖类、皂苷类等化学成分[1-2,17-19],其中生物碱、多糖、尿嘧啶等作为附子的药效成分[1-2,19-21]可能是引起小鼠机体内源性代谢物变化,增强机体能量代谢的药效物质基础。

根据通路富集分析和代谢网络分析结果,花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢通路可作为附子作用于机体的主要代谢通路,其中花生四烯酸代谢和亚油酸代谢涉及机体脂质代谢,烟酸和烟酰胺代谢属于辅助因子和维生素的代谢,三者对机体能量代谢非常重要。心血管疾病作为慢性病的一种,在机体能量代谢方面存在障碍[22-23]。附子作为温热药的典型代表,在心血管疾病治疗方面疗效显著,具有强心、抗心律失常、降血糖、调血脂、降血压等作用[2],故而附子发挥心血管治疗作用可能和提高机体能量代谢有关。

对代谢通路相关靶点分析,得出CYP450可能是附子作用于机体的主要靶点。与花生四烯酸代谢密切相关的CYP450在心血管疾病的发生发展过程中可能发挥着重要作用[24-25]。花生四烯酸在体内的3条代谢途径中,其中脂氧化酶(LOX)途径和环氧合酶(COX)途径已有深入研究,花生四烯酸在LOX途径中被转化为脂蛋白、白三烯等脂质介质[26]COX途径中COX-1COX-2亚型将其转化为前列腺素、前列环素或血栓素等[27],而CYP450途径作为花生四烯酸的第3代谢途径,目前还在不断研究中[28]。心脏中主要的CYP酶是CYP2家族的CYP2C8CYP2C9CYP2J2CYP4家族的CYP4ACYP4F[24],花生四烯酸在CYP酶(CYP2CCYP2J2)环氧化作用下,生成环氧二十碳三烯酸化合物(EETs),这些产物对维持心脏功能有重要作用[24,28];花生四烯酸在CYP酶(CYP4ACYP4F11/CYP4F12)羟化作用下,产生羟基二十碳四烯酸化合物(HETEs),导致心脏功能障碍[24,28]。因此,附子中双酯型二萜生物碱的心脏毒性[21]机制可能与以上CYP450作用相关。改变特异性CYP450环氧合酶和羟化酶的活性可能会影响EETsHETEs与心血管效应之间的平衡。机体脂质代谢失调常与炎症、肿瘤、糖尿病、神经退行性病变以及心血管疾病[28]等疾病相关。据此,CYP450的表达与心血管疾病(如高血压、心肌缺血和梗死、充血性心力衰竭和心律失常等)之间可能存在关联[29-31]。能够促使机体内源性代谢物花生四烯酸产生心脏保护性EETsCYP2C8CYP2C9CYP2J2和心脏毒性HETEsCYP4F11CYP4F12在本研究预测筛选到的CYP450中都可找到,本实验筛选得到的CYP2C8CYP2C9CYP2J2可能是附子治疗心血管疾病的生物靶标,但其具体的机制还需进一步实验研究。

参考文献(略) 

来  源:马茜茜,王春茜,杨秀娟,吴  茵,王朋倩,张  淼,霍海如,隋  峰.热性中药附子调节机体内源性代谢产物的分子作用机制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(24):6269-6277.

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