关于定量PCR,Cq(Ct)值的常见问题了解一下

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定量PCR中有一个很重要的概念—Ct值.那么Ct值究竟是什么呢,今天就来给大家讲一讲。

一、Ct值的名称

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多年来,Ct值被赋予了各种各样的名称,今天我们就来看看Ct值都有哪些名字:

Ct–循环阈值

Cp–交点

TOP-分支点

Cq–定量循环

这几个名字表达的都是一个意思。由于实时定量qPCR实验指南建议使用Cq值来命名该值,因此,接下来的内容,我们将统一使用Cq值来表示。

二、Cq值的定义

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实时荧光定量PCR 是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

关于定量PCR,Cq(Ct)值的常见问题了解一下

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1.阈值:

以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光域值定义为 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

2.CT值:

也称循环阈值,C代表Cycle,t代表threshold。其含义是:在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

三、常见问题

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1.预混液

Cq值会随着荧光发射的变化而变化,而荧光发射受溶液中pH值和盐浓度的影响,因此,请确保仅使用高质量的PCR组件,如使用自制溶液,每次实验前要检查pH值和盐沉淀监测。

2.被动参比染料

反应值是FAM荧光染料与ROX参比染料的比值。假设FAM荧光不变,ROX的用量越少,反应值越高。

3.模板太少

尝试使用更多模板。

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来源:

https://bitesizebio.com/24581/what-is-a-ct-value/

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