Science | 液液相分离新状态——于海洋等报道细胞内液晶结构的存在和形成,聚焦TDP-43形成非均质核壳小体

撰文 | 十一月

责编 | 酶美


RNA结合蛋白TDP-43的错误定位以及凝聚会形成细胞核内或者细胞质内的凝聚物,是包括脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)以及阿尔兹海默症(AS)等年龄依赖的神经退行性疾病的重要病理性标记【1-2】
近日,关于TDP-43再发重磅文章,加州大学圣地亚哥分校Don W.Cleveland研究组与Haiyang Yu(于海洋,第一作者)合作在Science发表Research Article文章,题为HSP70 chaperones RNA-free TDP-43 into anisotropic intranuclear liquid spherical shells揭开了生理水平下TDP-43在体内形成RNA非依赖的、HSP70分子伴侣调控的不均小体(Anisosomes)的现象,由于该核壳结构存在双折射率,首次指征了细胞内液晶结构的存在和形成,为揭开TDP-43在年龄依赖的神经退行性疾病中相分离状态的调控以及向凝胶状态以及固态转化过程提供了重要依据。
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十几年前,科学家们发现蛋白质、核酸或者是两者的混合物可以分层形成两相,一个是凝聚相,一个是稀释相,两者类似于油醋沙司中的醋和油一样,该现象被称为液-液相分离(Liquid-liquid phase separation)【3】。LLPS现象广泛参与到各种生物学过程之中包括重要的无膜细胞器和无膜结构的组装,比如中心体、核孔复合物以及超级增强子等等【4-5】。另外,凝聚相可以进一步分层形成胶状,比如核仁以及paraspeckles的形成等等6-7】
在该工作中,作者们介绍了一个有趣的新型LLPS现象,是由RNA结合蛋白TDP-43翻译后修饰所调控的核壳结构形成的非均质小体。外围由高浓度的液态的TDP-43组成,内部核心富含HSP70家族分子伴侣,形成了一个“液中有液”的新型液态结构(Liquid-inside-a-liquid-inside-a-liquid)。由于其各向异性和TDP-43在这个独特的无膜腔的差异分布,作者们将该小体将其命名为“anisosomes”,这个名字来自希腊语单词“anisos”和“soma”,意思是“不均匀的身体”。核壳结构表现出双折射特征,证实它们是由活细胞内的蛋白质形成的液晶结构。以下笔者将对该文章的内容进行详细解析。
TDP-43包含一个N端的自组装结构域,一个C端的低复杂区域LCD以及两个保守的RNA识别基序(图1)。与全长的TDP-43形成的“实心”液滴相比,这些RNA结合突变体可以在体内形成非常特别的不均小体结构(图1)。值得一提的是这些突变体的表达浓度远低于内源TDP-43初始生理浓度的情况下依然可以形成这样的不均小体,说明该不均小体的形成并非是由过表达引起的假象。通过荧光漂白恢复实验,作者们确认了该不均小体的外壳以及核心表现都类似于液态。

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图1 TDP-43的结构域以及不同突变体形成的不均小体
RNA结合结构域突变以及与乙酰化相关的突变体均能在细胞内形成不均小体,因此作者们思考是否是由于乙酰化的动态变化引发不均小体的形成,作者们发现通过施用药物抑制泛乙酰化酶活性足以驱动内源的TDP-43进入不均小体的外壳结构,增加乙酰化水平也可以驱动相同的结果出现。因此,TDP-43上的乙酰化修饰对于不均小体的形成非常关键。另外,因为RNA结合缺陷的TDP-43会被蛋白酶体快速降解,所以作者们在思考抑制蛋白酶体能否促进乙酰化的TDP-43形成不均小体。

的确,在神经元类似细胞中,单独抑制去乙酰化酶的活性只会造成TDP-43包含的液滴的小部分增长,但是在瞬时地、部分地抑制蛋白酶体的活性后,不均小体的数量以及尺寸会出现显著地增加。在大鼠和小鼠体内神经元中,降低蛋白酶体的活性也可以驱动不均小体的形成。因此,去乙酰化酶活性的抑制以及蛋白酶体的抑制在体外和体内均会驱动内源的TDP-43形成不均小体。
作者们利用完全消光显微镜(Complete extinction microscopy)发现RNA结合缺陷型TDP-43组成的外壳结构是为可见的非膜组分,其中还包括了各项异性的亚结构。而这一特性正暗示了该不均小体的液晶特征。那什么是液晶呢?液晶像传统液体一样流动,但包含非随机取向的分子,是可以产生双折射的各向异性的液体【8】。另外,作者们发现RNA结合缺陷型TDP-43能够招募内源野生型TDP-43进入不均小体的外壳和内部。
既然在体外和体内均证明了TDP-43不均小体的形成,那这些小体的功能是什么呢?内部是空心的还是由其他功能性蛋白组成的呢?为了回答这些问题,首先作者们对RNA结合缺陷型TDP-43形成的不均小体在细胞内与其他核内组分的分布进行了检测,发现RNA结合缺陷型的TDP-43形成的不均小体会将包括染色质在内的一些结构排除在外。另外,像FUS等RNA结合蛋白也会被排除在外。然而并非所有的RNA结合蛋白均会被排除在外,像hnRNPA2B1、hnRNPH1以及hnRNPK则会自由进出该不均小体结构。说明TDP-43所形成的不均小体对细胞核内的一些组分具有选择性。
值得一提的是,在细胞进行有丝分裂的时候,细胞内的不均小体仍然能够完好无损的暴露其中,然后也会被排除在分裂后间期的细胞核之外(图2)。这与其他大部分现在已经发现的在有丝分裂期间会消失的小体完全不同。

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图2 TDP-43形成的不均小体在有丝分裂仍保持完整
另外,通过建立数学模型,作者们推断出不均小体内部存在未知的组分。为此,作者们将临近标记方法与免疫共沉淀以及定量质谱技术相组合,发现不均小体中富含HSP70家族的分子伴侣(图3)。而且,作者们发现ATP依赖的HSP70分子伴侣活性对于不均小体结构的完整性非常关键。

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图3 TDP-43组成的不均小体中富含HSP70家族分子伴侣蛋白
总的来说,作者们发现脊髓侧索硬化症相关突变、乙酰化模拟突变或者是增加野生型TDP-43乙酰化的水平均会通过降低TDP-43的RNA结合能力降低其RNA结合驱动的液-液相分离,从而促使RNA结合缺陷型的TDP-43形成不均的、液态的核壳结构。作者们提出的模型说明HSP70家族在不均小体形成中的重要作用——持续的伴侣活性是产生和维持外壳和内核流动性所必需的关键因素。TDP-43和HSP70分子伴侣在驱动和维持TDP-43相分离和阻止TDP-43聚集方面是重要的伙伴关系。因此,该研究对于TDP-43相分离介导的年龄依赖的神经退行性疾病的治疗和药物研发提供了新的参考。
原文链接:
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/12/16/science.abb4309
制版人: 启萌之星

参考文献

1. Neumann, M. et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science (New York, N.Y.) 314, 130-133, doi:10.1126/science.1134108 (2006).
2. Taylor, J. P., Brown, R. H., Jr. & Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature 539, 197-206, doi:10.1038/nature20413 (2016).
3. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A. & Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature reviews. Molecular cell biology 18, 285-298, doi:10.1038/nrm.2017.7 (2017).
4. Woodruff, J. B. et al. The Centrosome Is a Selective Condensate that Nucleates Microtubules by Concentrating Tubulin. Cell 169, 1066-1077.e1010, doi:10.1016/j.cell.2017.05.028 (2017).
5. Hnisz, D., Shrinivas, K., Young, R. A., Chakraborty, A. K. & Sharp, P. A. A Phase Separation Model for Transcriptional Control. Cell 169, 13-23, doi:10.1016/j.cell.2017.02.007 (2017).
6. Feric, M. et al. Coexisting Liquid Phases Underlie Nucleolar Subcompartments. Cell 165, 1686-1697, doi:10.1016/j.cell.2016.04.047 (2016).
7. West, J. A. et al. Structural, super-resolution microscopy analysis of paraspeckle nuclear body organization. The Journal of cell biology 214, 817-830, doi:10.1083/jcb.201601071 (2016).
8. Pelzl, G. & Hauser, A. J. P. T. Birefringence and phase transitions in liquid crystals.  37, 33-62 (1991).
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