植物单细胞测序:一种研究植物功能基因组学的高分辨途径 | 原生质体专题

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上期原生质体专题中科院博士自述:选择硕博研究方向的原因让人大跌眼镜 | 原生质体专题发布之后,后台收到很多老师的留言夸赞张琦博士的原生质体制备的非常不错,想再多了解一下相关知识。今天这期原生质体专题,我们的张琦小姐姐又带来了时下大热的单细胞转录组学干货,文末还有关于平衡细胞数和测序量的惊喜问答植物单细胞文章大盘点,另外还附赠几篇免费植物单细胞文献供老师们下载。

植物各个组织中单个细胞协同作用赋予植物组织不同的功能。RNA-SEQ技术和组织处理技术,能够在单细胞分辨率下捕捉细胞转录水平的变化。单细胞RNA-SEQ在基于单细胞水平探索复杂组织中调控过程方面有着巨大的潜力。而且单细胞水平的研究不依赖于报告株系,可以对任何植物中的任何给定组织进行分析。虽然对单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术产生的大量数据进行处理和分析存在一些挑战,但通过绘制植物细胞图谱,描绘细胞功能和细胞间的相互作用,可以获得空前详细的植物组织功能信息,并促进其应用。


单细胞测序简介
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单细胞测序技术应用于植物,有助于揭示植物发育和胁迫适应所涉及的基本细胞活动。基于微流体的单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法的最新进展,可以研究任何特定生物体在细胞分辨率下的转录变化。在以动物为基础的研究中,scRNA-seq已经彻底改变了细胞研究现状。除了促进发现新的细胞类型外,单细胞测序还可以研究细胞基因调控网络中的机制和原理,以及细胞命运决定和器官功能背后的基因表达水平变化。今天我们讨论植物中进行scRNA-seq相关的机遇和挑战。


分析细胞信号网络的常用方法
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在scRNA-seq技术出现之前,单细胞水平分析主要依赖于激光显微解剖(LMD)和荧光激活细胞分选(FACS)。LMD通量低,技术门槛高,难以绘制细胞图谱。第一张植物细胞图谱是包含三个发育阶段,五种细胞类型的拟南芥根的细胞图谱,由FACS和芯片测序技术结合绘制。但FACS对荧光标记的依赖使其在应用范围仅限于在模式植物(主要是拟南芥)中对已知细胞类型研究。

Drop-Seq是第一项使用微流控技术结合barcode系统的对单个细胞进行高通量测序的scRNA-seq技术。这一开创性的新方法改变了之前的单细胞分析方法,但它的转录本分辨率较低,所以获得的信息可能仅限于高表达的基因,而最新的单细胞技术10X Genomics与高效的组织裂解方案相结合,细胞的捕获效率和基因检测效率都有所提升,进一步提高了单细胞分析的分辨率。表1罗列了现有的基于微流控技术的单细胞测序平台特征和优劣势。

表1.现有的基于微流控技术的单细胞转录组平台对比

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ScRNA-seq在植物上的应用
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对于植物来说,单细胞实验在收集细胞之前,需要通过酶消化去除细胞壁(原生质体制备)。细胞壁组成的不同和组织内细胞层的位置的不同可能导致收集到的细胞类型有一定的偏好性,所以在提取原生质体的过程中应充分考虑,消除偏好性。此外,需注意最终进入到到单细胞系统的原生质体培养液的以下性质(Ⅰ)粘度和结晶程度;(Ⅱ)兼容性(例如,含Ca2+的培养液会导致系统内沉淀);(Ⅲ)需要一定的渗透压以维持细胞的活力,但又不会诱导细胞内转录本的变化,例如,乳糖具有类似于蔗糖的渗透特性,而后者可以被植物细胞感知并调节与能量相关的信号通路的基因表达水平,其余实验及分析流程与动物单细胞研究一致,不做赘述。


拟时序分析揭示植物发育
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目前植物单细胞的研究主要集中在根组织,除了原生质体易于制备之外,根的组织的细胞类型具有的规律性也是吸引研究者的重要因素,从根分生组织中的干细胞龛、未分化细胞,伸长区的新分化细胞到根成熟区的完全分化细胞之间存在明确的发育关系。“伪时间”的概念用来研究未分化的分生组织细胞向成熟组织的分化的过程,以及不同的发育阶段对应着细胞基因表达谱变化。但是,细胞可能会以不同的速度转化,这种异步性意味着基因表达的变化不应该随时间而变变化,而应该随着发育过程而变化。伪时间是捕捉这一进程的抽象度量。伪时间算法(如Monocle,TSCAN)通过沿着发育轨迹排序单个细胞,可以描述单个细胞逐渐转变的时间和趋势。Denyer在2019年首次使用伪时间揭示了从根分生组织到成熟组织的大规模分化情况。


ScRNA-seq在植物研究中的潜力
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ScRNA-seq可能有助于我们进一步理解植物染色体倍性的功能意义。植物根细胞染色体倍性随着细胞发育而增加,这个过程是由核内复制(没有有丝分裂的细胞周期)驱动的,作为固着生物,植物暴露在极端和不稳定的环境条件下,染色体加倍可以增加细胞和基因组的稳定性,提高植物的抗逆能力。

ScRNA-seq同样有助于研究不同状态细胞应激反应的基因表达差异。研究结果表明,当应用像热休克这样的强处理时,应激反应会导致细胞类型已知的marker基因下调,对于细胞的分类和鉴定造成一定困难。在实验和分析过程中应当考虑这一过程并尽可能加以修正。


结束语
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scRNA-seq具有的高时空分辨率,使研究者能够虚拟地解剖和仔细观察整个生物体。然而,要对单细胞中基因调控网络的组织有更详细的了解,还需要进一步的技术进步,例如,在单细胞测序过程中捕获、标记技术的提高和生物信息学分析的开发。新的技术发展提高了单细胞测序测量的范围和分辨率,例如在单细胞水平上的ATAC-SEQ能够提供染色质可接近性的信息,揭示单个细胞中基因转录活跃的区域。此外,scRNA-seq数据与成像技术的结合能够重建组织中细胞类型和细胞状态,scRNA-seq技术具有非常好的前景,特别是与细胞表观遗传学(例如,基于SCATAC-SEQ)、多组学方法、高分辨率成像和时空分辨细胞工程相结合,能为基础研究提供重要信息,例如绘制植物细胞图谱揭示细胞之间的相互作用解析植物器官形成过程中细胞的作用,以及细胞如何应对病原体入侵和环境变化等,除了推进基础研究之外,一个全面的植物细胞图谱还将为提高农业生产力的研究奠定良好的基础。

惊喜问答小彩蛋放送

很多老师可能对细胞数和测序量两者之间该如何平衡有疑问,这里整合了下述几点问题供老师们参考:

1.scRNA-seq的考虑因素:多少个细胞足够?

单个样本中细胞捕获数从1000个到8000不等。在确定预期捕获细胞数量时,应当考虑研究中感兴趣的最稀有细胞类型的捕获率。如果预计要捕获的细胞数量将远远小于1000个,则应考虑使用更基础的方法,如SMART-seq2。

2.捕获细胞数如何影响下游分析?

细胞数量影响下游分析的分辨率,也就是说,细胞不足意味着在所有群体中信息不全,marker基因/差异表达(DE)基因可能很难检测到。稀有细胞群可能丢失。仔细选择与实验要求相匹配的单细胞平台可以缓解这一问题。

3.测序深度如何影响下游分析的灵敏度?

单细胞分析所需的测序深度取决于平台和实验设计。10x建议对每个细胞至少测20,000条reads。测序饱和度可以用来度量文库是否已经进行了足够的测序,而这又取决于实验设计。如果实验目的是检测低表达的转录本,则需要大于90%的测序饱和度。如果目的是细胞聚类成群,并加以注释,进行下游分析,较低的测序饱和度是可以接受的。

4.细胞数量和每个细胞的测序深度之间的权衡是什么?

基于以上考虑,实验设计应当确定测序过程中优先考虑细胞数量还是测序深度。


文章的最后,为各位老师送上植物单细胞文章大盘点和几篇免费植物单细胞文献的下载地址:

植物单细胞文章大盘点

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植物单细胞文献下载:

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