淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

摘  要:目的  筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法  按《中国药典》2020年版制备淡豆豉;采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛;将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养,获得纯种发酵液,用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力;应用16S rDNA18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果  筛选获得3种产纤溶酶细菌,分别为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示,嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高,达527.49 IU/mL结论  淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株,淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。

淡豆豉Sojae Semen Praeparatum,又名香豉、淡豉、豆豉,作为一味药食两用传统中药至少己有1 700余年的应用历史。其为豆科植物大豆Glycine max (L.) Merr.的成熟种子的发酵加工品,以黑色种皮品系大豆为主要原料,桑叶、青蒿为辅料经发酵炮制而成。

历版《中国药典》记载淡豆豉的功效和主治为解表、除烦、宣发郁热,用于感冒、寒热头痛,烦躁胸闷,虚烦不眠等。目前针对淡豆豉的研究主要集中在药理作用、活性物质、炮制工艺优化、质量评价等[1-4]。研究表明淡豆豉具有抗肿瘤、防治动脉粥样硬化、防治骨质疏松和糖尿病以及抗菌等药理学作用[5-9],目前普遍认为大豆异黄酮类是淡豆豉主要活性成分。古今应用和现代研究均未涉及淡豆豉的溶栓作用。

血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类生命健康的心血管疾病,其病因是纤维蛋白聚集于动脉管壁所导致。溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。纤溶酶是能催化纤维蛋白水解而溶栓的蛋白水解酶,广泛存在于生物体中。目前,关于淡豆豉炮制中产生纤溶酶的研究报道非常少。检索文献,国外无淡豆豉纤溶酶的报道,国内主要是对不同产地中药淡豆豉活性成分的变化研究[10-11]以及采用传统微生物学方法对淡豆豉炮制阶段优势菌株进行筛选与分离鉴定[12-13]。本课题组前期研究发现淡豆豉炮制过程中存在高活性纤溶酶[14]。淡豆豉炮制过程中的纤溶酶是如何产生的?产纤溶酶的优势菌又是什么?其所产纤溶酶活力如何?基于此,本研究采用传统微生物学方法结合现代分子生物学技术,首次对淡豆豉炮制过程中不同时间点样本中产纤溶酶的优势菌株进行筛选、鉴定和纯种发酵液纤溶酶活力测定,获得高产纤溶酶的优势菌株。研究结果将为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础,对进一步发掘淡豆豉的溶栓新功效具有重要意义。

1  材料与仪器

黑大豆、桑叶、青蒿均购自安国冷背药材有限公司,由江西中医药大学附属医院杨安金主任中药师鉴定,分别为豆科大豆属植物大豆Glycine max (L.) Merr.的成熟种子,桑科桑属植物桑Morus alba L.的干燥叶,菊科蒿属植物黄花蒿Artemisia annua Linn.的干燥地上部分。

尿激酶(批号140604-201224)、牛纤维蛋白原(批号140626-201611)、牛纤维蛋白溶酶原(批号140606-201325)、牛凝血酶(批号140605-201526)均购自中国食品药品检定研究院。琼脂糖,批号GS201-01Invitrogen公司。

细菌基因组DNA提取试剂盒(批号DP302-02)、植物基因组DNA提取试剂盒(批号DP305-02)、2×Taq PCR master Mix(批号KT201- 02),天根生化科技有限公司;DM2000 Marker(批号CW0632S),康为世纪生物科技有限公司;Golden View(批号EP0601),Biomed公司;脑心浸液肉汤培养基(批号HB8297-1)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(批号HB0233),青岛高科园海博生物技术有限公司;蛋白胨(批号P8450)、硫酸链霉素(批号S8290)、琼脂粉(批号409Y029)、酪蛋白(批号C8210),北京索莱宝公司;酵母膏(批号01-014),北京奥博生物技术有限责任公司。其他试剂均为分析纯。

细菌发酵培养液:脑心浸液肉汤培养基38.5 g/L(固体培养基加2%琼脂粉)。

霉菌发酵培养液:蛋白胨20 g/L、葡萄糖各20 g/L,酵母膏10 g/L,硫酸链霉素40 mg/L(用时现加)(固体培养基加2%琼脂粉)。

酵母菌发酵培养液:马铃薯葡萄糖琼脂培养基37 g/L,硫酸链霉素40 mg/mL(用时现加)(固体培养基加2%琼脂粉)。

Advantage A10MILLI-Q超纯水仪,Millipore公司;SIGM2-16K高速低温离心机,Sigma公司;DHP-9082细菌培养箱、MJ-150Ⅰ霉菌培养箱,上海一恒科技有限公司;PTC-200普通PCR仪,BIO- RAD公司;Ose-470p凝胶成像紫外分析仪,天根生化科技有限公司。

2  方法

2.1  淡豆豉的炮制和取样

本课题组前期参照《中国药典》2010年版已建立规范的淡豆豉炮制工艺[14-15](历版《中国药典》记载的淡豆豉制法相同,含2020年版)。具体炮制工艺如下:取桑叶90 g、青蒿100 g,分次加入生药量18倍水煎煮3次,每次1 h,滤过,合并3次滤液,药液浓缩至1 000 mL。将黑大豆洗净并于40 ℃烘干至恒重(约烘3 d),取1 000 g黑大豆拌入上述药液中,药液吸尽至豆粒充分饱胀为度(约6 h)。将豆粒置于蒸锅内,隔水蒸1.5 h,取出,摊凉,置竹编中,用煎煮过的桑叶、青蒿药渣覆盖,放入温度为(30±2)℃、湿度为70%的培养箱内进行自然发酵,定时翻动,发酵6 d至豆粒表面均匀布满黄衣(称“黄衣上遍”,此过程每3 d取样1次,为发酵第36天样品),取出,除去药渣,洗去黄衣,置陶瓷圆形容器中,桑叶、青蒿渣覆盖,盖容器盖并用水密封,进入“再闷”环节:置温度为(30±2)℃、湿度为70%的培养箱再闷1520 d,再闷期间每3 d倒出,翻动(此过程在再闷第36912151820 d取样),至充分发酵,香气溢出时取出。最后蒸0.5 h37 ℃干燥,即为淡豆豉成品。其成品性状:表面黑色,皱缩不平。质柔软,断面棕黑色。香气浓郁,味微甘。成品性状和各项理化指标均符合《中国药典》2020年版要求。各样品尽快置于4 ℃保存,1周内完成检测。

2.2  淡豆豉炮制过程中不同时间点样本的微生物培养和菌落计数

按照实验室前期确定的实验方法[16]对淡豆豉炮制过程中不同时间点各样本的微生物进行培养。具体如下:称取各样本1.0 g,置灭菌研钵研磨后倒入无菌EP管中,加无菌生理盐水至10 mL,置摇床震荡30 min。吸取1 mL样液到另一装有9 mL无菌生理盐水的EP管中,摇匀,依次稀释为0.10.011×1031×1041×1051×1061×1071×1081×109。分别吸取9个稀释梯度的100 μL稀释液均匀涂布于细菌、霉菌、酵母菌选择性固体培养基上,细菌置37 ℃培养箱中培养约24 h,酵母菌和霉菌置28 ℃培养箱中培养约72 h。依据培养皿上的菌落数(肉眼可计数范围),选择3个合适的稀释梯度重复实验,并分别进行菌落计数,尽可能挑选更多的优势微生物进行纯化并保菌。

纯种液体发酵:将保存的微生物活化后分别接种于相应的液体培养基,28 ℃、220 r/min培养72 h,取发酵液500 μL9 659.52×g离心5 min,上清进行纤溶酶活力测定。

2.3  产纤溶酶微生物的筛选

2.3.1  产纤溶酶微生物的初筛

1制备酪蛋白平板[17]Na2HPO4 1.3g/LZnSO40.02 g/LKH2PO40.36 g/LCaCl22 mg/LNaCl 0.1 g/L、琼脂粉15 g/L、酪蛋白4.0 g/LpH7.2

2产纤溶酶微生物的初筛:根据“2.2”项菌落计数的结果,分别选取各样本合适稀释梯度的稀释液100 μL涂布于酪蛋白平板上进行产纤溶酶微生物的初筛,置于37 ℃培养箱培养13 d,挑取产生透明圈的菌落。

2.3.2  产纤溶酶优势菌株复筛

1制备琼脂糖-纤维蛋白平板:称取纤维蛋白原18.0 mg溶解于10 mL灭菌生理盐水中,配制成纤维蛋白原溶液,于37 ℃水浴保温;称取0.16 g琼脂糖加双蒸水定容至10 mL并煮化,待冷却至55 ℃左右加入0.1 mL凝血酶(160 BP/mL),摇匀后加入配制好的纤维蛋白原溶液,迅速摇匀后倒入直径为100 mm的平皿中,室温平放1 h以上,待平板凝固后现用或置于4 ℃冷藏备用。

2验证纤溶活性:将在初筛中获得的产生溶解圈的菌落接种至相应的发酵培养液中,37℃、 200 r/min培养24 h,收集菌液并离心取上清,取10 μL上清液加入到琼脂糖-纤维蛋白平板小孔中验证其纤溶活性,有透明水解圈的即为产纤溶酶的优势菌株。

2.4  产纤溶酶优势菌株鉴定

2.4.1  形态学鉴定  接种环蘸取复筛获得的产纤溶酶菌株,分别划线于细菌、霉菌、酵母菌选择性固体培养基中进行活化培养,细菌置37 ℃培养箱中培养约24 h,酵母菌和霉菌置28 ℃培养箱中培养约72 h。对产纤溶酶微生物菌落进行肉眼观察和显微镜下观察其形态特征。

2.4.2  分子生物学鉴定  菌株的分子生物学鉴定按照课题组前期已发表论文中的方法[16],采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取,植物基因组DNA提取试剂盒提取真菌DNA。细菌采用16S rDNA的通用引物27F/1492R进行扩增,PCR扩增条件如下:模板DNA 2 μL,上下游引物各1 μL(浓度10 μmol/L),2×Taq PCR master Mix 12.5 μL,补充ddH2O25 μL;反应程序:95 ℃、3 min94 ℃、30 s56 ℃、30 s72 ℃、1.5 min30个循环;72 ℃、10 min。真菌采用18S rDNA通用引物ITS1/ITS4进行扩增,PCR扩增条件如下:模板DNA 2 μL,上下游引物各1 μL(浓度10 μmol/L),2×Taq PCR master Mix 12.5 μL,补充ddH2O25 μL。反应程序:94 ℃、1 min94 ℃、30 s56 ℃、30 s72 ℃、1 min30个循环;72 ℃、10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果在NCBI网站上进行比对,下载同源性高的序列及模式菌株的序列,选用MEGA 4.1软件上的Clustal W功能进行序列比对,Kimura 2模型计算序列距离矩阵的系数,和邻接法(NJ)构建目的序列的系统发育树,bootstrap值设为1 000

2.5  纤溶酶活力测定

纯种发酵液的纤溶酶活力,采用纤维蛋白平板法[14,18]进行测定,以尿激酶为标准品。实验中制备2组纤维蛋白平板,取其中1组平板置于电热恒温培养箱中85 ℃加热30 min制成加热平板(烤板),另1组纤维蛋白平板为未加热平板(常温板),将2组纤维蛋白平板用于纯种发酵液的纤溶酶活力测定,用以判断淡豆豉纤溶酶降解纤维蛋白的作用方式。

3  结果与分析

3.1  产纤溶酶微生物的筛选

3.1.1  产纤溶酶微生物的初筛  通过酪蛋白平板法对各样本进行产纤溶酶优势菌的初筛,挑取在酪蛋白平板上产生透明溶解圈的菌落进行液体培养。为确保产生透明溶解圈的菌落是单菌落,用接种环蘸取菌液在酪蛋白平板上再次划线分离,重新挑取产生溶解圈大的单菌落进行液体纯种培养,产纤溶酶菌株的初筛结果如图1所示。

 

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

3.1.2  产纤溶酶微生物的复筛  将酪蛋白平板上初筛获得的具有蛋白酶活力的菌株进行液体纯培养,收集菌液并离心取上清,采用纤维蛋白平板法验证纤溶酶活性,如图2所示。对发酵液在纤维蛋白平板上产生透明溶解圈的菌落进行保菌和后续的分子生物学鉴定。

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

由图2可知,经酪蛋白平板初筛确认产生透明溶解圈的菌株,在纤维蛋白平板上进行纤溶活性的验证,结果显示,只有部分菌株的发酵液在纤维蛋白平板上产生明显的透明溶解圈。

通过纤维蛋白平板复筛,课题组筛选获得21株能够分泌产生纤溶酶的菌株,编号分别为1121719212226293032(编号中缺失的序号为仅在酪蛋白平板上产生透明溶解圈,在纤维蛋白平板上未产生溶解圈的菌株号)。

3.2  产纤溶酶优势菌株鉴定

3.2.1  形态学鉴定  经肉眼观察菌落和革兰氏染色镜检,初步鉴定复筛获得的21株菌均为细菌。其中13株(编号分别是34810122122262932)具有相似的形态特征:菌落光滑、细小、呈透明状,革兰氏染色均为阴性的杆状细菌,且产生了抗硫酸链霉素抗性;7株(编号分别是12571119)具有相似的形态特征:菌落大,灰白色,表面粗糙不规则,有很多隆起和皱褶(其中6号和7号的菌落形态与其他5株菌略有不同,呈蜡状),革兰氏染色均为阳性的杆状细菌;1株(17号)为革兰氏阳性圆球状细菌(图3)。

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3.2.2  分子生物学鉴定  采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取21株产纤溶酶菌株的DNA,并用16S rDNA的通用引物27F/1492R21株产纤溶酶菌株进行PCR扩增,结果发现均扩增出目的DNA条带(图4);采用植物基因组DNA提取试剂盒提取13株产生了抗硫酸链霉素抗性菌株的DNA,并用18S rDNA通用引物ITS1/ITS413株产纤溶酶菌进行PCR扩增,结果均无目的DNA被扩增,再次说明此13株菌为产生了抗硫酸链霉素抗性的细菌,与形态学和革兰氏染色鉴定结果一致。

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21株产纤溶酶菌株的PCR产物送测序公司测序。测序结果通过NCBI进行序列比对,同时对产纤溶酶的菌株构建系统发育树进行分子生物学鉴定。为了使鉴定结果更为准确,采用相似属种进行了建树,见图5。分子生物学鉴定结果为12571119号菌株均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis34810122122262932号菌均为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia17号菌为微球菌Micrococcus

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3.3  产纤溶酶菌株纯种发酵液纤溶酶活力测定

纯种发酵液的纤溶酶活力采用纤维蛋白平板法测定:将10 μL纯种发酵液样品分别点到常温板和烤板的孔中(若酶活力测定结果不在标曲范围内,则相应改变酶液上样量),37 ℃恒温培养箱中温育18 h,测量溶解圈的垂直直径并计算两者的乘积,即溶解圈面积。根据尿激酶标准曲线(Y2.924 3  X4.377 7r20.994 3)计算出待测酶液的纤溶酶活力。

经初筛和复筛获得的21株产纤溶酶菌株的纯种发酵液酶活力测定结果显示:1251119号菌产生的纤溶酶活力和作用方式相同(命名为淡豆豉纤溶酶SFE1SSP Fibrinolytic Enzyme 1),同是枯草芽孢杆菌的6号和7号菌,其发酵液的纤溶酶活力较前者有所下降,作用方式也与前者不同(命名为SFE2);同是嗜麦芽窄食单胞菌的34810122122262932号菌,其中3481012号菌所产纤溶酶的纤溶酶活力和作用方式相同(命名为SFE3),2226号菌所产纤溶酶的酶活力和作用方式相同(命名为SFE4),212932号菌所产纤溶酶的活力和作用方式相同(命名为SFE5);17号微球菌所产纤溶酶的酶活力最低(命名为SFE6)。具体酶活力详见表1。从表1可知,嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶的酶活力最高,其次是枯草芽孢杆菌,微球菌最低。此外,在嗜麦芽窄食单胞菌中,存在3个亚种,所产纤溶酶酶活力最大的为SFE5,其次是SFE3,最小的是SFE4;在枯草芽孢杆菌中,存在2个亚种,所产生的纤溶酶SFE1酶活力明显高于SFE2

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4  讨论

近年来,我国的微生物学工作者已从发酵豆制品中成功筛选到产纤溶酶的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和绿脓杆菌和沙雷氏菌等[19-21],并将分离到的纤溶酶命名为豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic EnzymeDFE)。目前,关于淡豆豉炮制中产纤溶酶的研究报道非常少。检索文献,目前国外无淡豆豉纤溶酶的有关报道,国内涉及自然炮制淡豆豉纤溶酶的研究,共发表研究论文5[10-14],主要采用传统微生物学方法对不同产地中药淡豆豉饮片进行了优势菌的筛选、鉴定及酶活力测定。本研究采用传统微生物学方法结合现代分子生物学技术,对淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株进行了筛选、鉴定和纯种发酵液纤溶酶活力测定。首次从淡豆豉炮制中分离获得产纤溶酶的优势菌株:枯草芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和微球菌。

嗜麦芽窄食单胞菌广泛分布在水、土壤中,具有高代谢能力,快速分解麦芽糖而迅速产酸,可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖等24种物质。嗜麦芽窄食单胞菌在其它生态学研究中较为多见,在食品发酵中的研究仅本课题组有过报道,本课题组在淡豆豉微生物的PCR-DGGE研究中,发现枯草芽孢杆菌在整个炮制过程中作为优势菌始终存在,嗜麦芽窄食单胞菌在淡豆豉炮制至“黄衣上遍”过程大量存在,“再闷”3 d后数量降低[22]。初步推测枯草芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌可能在淡豆豉纤溶酶形成中起重要作用。

3种产纤溶酶优势菌进行分子生物学鉴定的结果显示:鉴定为枯草芽孢杆菌的7株菌(编号为12571119),尽管16S rDNA序列完全相同,但是6号和7号菌的菌落形态均呈蜡状,不同于其它5株枯草芽孢杆菌的菌落形态。此外,纤溶酶活力测定的结果也显示6号和7号菌所产纤溶酶(SFE2)的酶活力和作用方式均不同于12571119号菌所产纤溶酶(SFE1),SFE1的酶活力高于SFE2,但SFE1只能直接降解纤维蛋白,而SFE2不仅能够直接降解纤维蛋白,还能通过激活纤溶酶原间接降解纤维蛋白。这些都说明2组枯草芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌的不同亚种。同样地,鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌的13株产纤溶酶的菌株,存在3个不同亚种:所产纤溶酶(SFE3SFE4SFE5)的酶活力和作用方式不同。其中SFE4SFE5的作用方式相同,只能直接降解纤维蛋白,而SFE3不仅能够直接降解纤维蛋白,还能通过激活纤溶酶原间接降解纤维蛋白。

本研究鉴定出的6种淡豆豉纤溶酶的分子生物学信息、酶学性质、生化特性,3种产纤溶酶细菌在淡豆豉炮制中的数量变化、以及与其它微生物在淡豆豉纤溶酶形成中的调控机制等均有待后续进一步深入研究。本研究将为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础,对进一步发掘淡豆豉的溶栓新功效具有重要意义。

参考文献(略) 

来  源: 翁美芝,邓雄伟,王立元,苏明声,周  丽,谢小梅.淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定 [J]. 中草药, 2020, 51(24):6221-6228.

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