【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究

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【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究
【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究
关键词:空间单细胞多组学;模板;
前言:
单细胞测序研究已经快速应用在临床科研中,并且不断推陈出新。面对这一新技术,我们之前曾组织过多次学术交流。
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但仍有很多朋友感到茫然无从下手,尤其是几位有基金的朋友,想做创新性探索研究
为此,我们转发由Grayson编译的这篇文章;来源公众号“BioMed科研随笔”。
文章很长,但是相信您读完之后,肯定会很有收获;如果您想继续读原文,可直接通过参考文献链接获得。
【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究
单细胞测序是近几年生命科学领域最热门的新技术之一,目前已经在肿瘤、发育、免疫、疾病等多个领域广泛应用。
single cell RNA-seq单细胞转录组测序通常需要在获取新鲜样本后立即将组织样本解离成单细胞悬液,而很多临床肿瘤样本需要等待病理结果才能确定样本是否符合要求;如果组织中含有某些比较脆弱的细胞、或直径大于40μm的细胞,如心肌细胞、肾小球足细胞、内皮细胞等,那单细胞测序就无法达到要求。
因此,BRAOD研究所AvivRegev和加州大学张琨教授等多个研究团队开发和优化了单细胞核测序single nucleus RNA-seq技术,不管是冰冻样本还是含有大细胞、脆弱细胞的组织,都可以通过抽核的方法获得整个组织中的单细胞核图谱,由此单细胞核具有比single cell更加广泛的应用前景。
 
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在关注单细胞基因表达的同时,也有很多研究人员比较关注这些基因为什么会发生上下调改变,去研究上游的转录调控机制,比如DNA甲基化、染色质开放性、转录因子和组蛋白调控等,其中用于研究染色质开放性和转录因子结合的ATAC技术是比较受关注且已实现商业化的技术。单细胞scATAC和单细胞scRNA联合应用,更是已经有多篇文章发表。
 
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单细胞测序或单细胞核测序,能够获得组织的细胞图谱,解决细胞异质性的问题,但还无法知悉每种细胞的空间分布。
因此Luderburg等研究者陆续开发了空间转录组测序,这个技术能够高通量的研究组织样本中不同细胞类型及其不同基因的空间分布信息。但由于最新空间Visium技术还达不到单个细胞/spot的分辨率,因此目前比较常见的是空间转录组联合单细胞测序技术一起应用。目前也有多篇文章发表。
 
近日,德国亚琛大学&荷兰鹿特丹伊拉斯谟医学中心Rafael Kramann教授等在预印本bioRxiv发布了Spatial multi-omic map of human myocardial infarction的研究论文,这是目前全球第一篇将空间单细胞多组学技术应用到研究中并即将发表的论文

作者采用单细胞核转录组scRNA-seq单细胞核染色质可及性scATAC-seq和空间转录Visium技术,对4例心肌梗死患者和1例健康供者的8例左心室标本(包括心肌梗死对照心肌样本不同生理区不同时间点)进行检测,以定位处于稳态和心肌梗死后不同阶段的人类心肌组织,并生成了心脏重构的多组学高分辨率整合图谱。
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包括心肌梗死(myocardial infarction,MI)在内的心血管疾病是世界范围内死亡的主要原因。心肌梗死后,炎症和修复反应会引发广泛的心肌重构,从而影响心功能。虽然在急性治疗方面取得了很多进展,但由于对心脏重构过程的不完全了解,晚期死亡率仍然很高。因此了解心脏特有的细胞内和细胞间信号机制来协调这种重塑是开发新疗法的关键。
 
作者通过多组学联合的方法,提高细胞类型组成的空间分辨率,并通过识别损伤、修复和重塑的不同细胞区域,提供对心脏转录组和表观基因组的空间分辨率洞察力。鉴定并验证了成纤维细胞向肌成纤维细胞分化从而驱动心脏纤维化的机制。提供了一个完整的人类心肌梗死分子图谱,为进一步研究心脏病的机制和治疗提供了参考。
 
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下面是翻译全文
 
前 言
冠心病导致的急性心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)是心血管疾病死亡率的最大贡献者,这反过来又是全世界所有死亡的主要原因。主要集中在经皮冠状动脉介入治疗的MI的急性治疗取得了巨大进展,导致急性死亡率下降。然而,MI后左心室心脏重构导致的发病率和死亡率仍然不可接受地上升。MI后的心脏重构涉及免疫细胞的募集和梗死区的划分,其次是组织消化,吞噬,了解从急性缺血事件到慢性心脏瘢痕形成的心脏重构过程在其空间背景下的确切细胞和分子机制将是开发新疗法的关键。
在这里,我们使用单细胞基因表达和染色质可及性技术和空间分辨转录组学相结合的方法来研究基因调控中细胞类型的特异性变化,提供心肌梗死后心脏重塑的完整图谱。我们定义了候选顺式DNA元件(CREs,调节相邻基因转录的非编码DNA区域),揭示了在健康和疾病中控制特定心肌细胞类型的基因调控网络。我们将这些信息投射到特定的组织位置,从而使我们能够在空间上定位控制基因调控的假定增强子,例如在心肌边缘区域。这反过来又使我们能够对驱动心脏瘢痕形成中成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的基因调控程序获得新的见解。
我们的结果为人体心脏在稳态和心肌梗死后的基因调控提供了一个全面的空间分辨特征。我们预计,这些数据将成为该领域的参考图,并可用于未来的研究,并最终用于新疗法的开发。
 
材料与方法
1、样本:
4例心肌梗死患者、1例健康供者,8例左心室组织标本;分为缺血坏死区、边界区、远端区、纤维化区,每个区各2个样本。
2、技术:
10XGenomics公司snRNA-seq + scATAC-seq + Visium(spatial transcriptomics) 【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究

 
结  果
1、Integrative spatial and single-cell genomics of the human heart 完整的人类心脏空间和单细胞基因组学
我们应用一体化的单细胞基因组策略,结合单核RNA测序(snRNA-seq)和单核转座酶可及染色质测序(snATAC-seq),以及来自同一组织的空间转录(10XGenomics Visium),以前所未有的空间和分子分辨率绘制了处于稳态和心肌梗死后的人类心肌细胞图(图1a-c)。
我们将未移植供心(对照组,C)作为对照,急性心肌梗死患者坏死区(缺血区,IZ)、边缘区(BZ)未受影响的左心室心肌(远区,RZ)进行对比分析(图1a)。这些急性心肌梗死标本取自临床症状(胸痛)出现2-5天后移植的心脏,在患者因心源性休克接受全人工心脏手术之前并作为移植的桥梁。我们还分析了两例心肌梗死后晚期(3个月和12年,纤维化区FZ)合并缺血性心力衰竭的人的心脏标本,这些标本是由于原位心脏移植而获得的。未移植的供者心脏作为对照(临床特征在扩展数据图1a中概述)。我们获得了每个心脏标本的10µm冰冻切片,并从与冰冻切片直接相邻的其余标本中分离出细胞核,随后进行了荧光激活核分选(FANES)后的snRNA-seqsnATAC-seq(图1b)。
我们获得了总共40530个核的基因表达数据,平均每个核1335个基因,以及总共18213个核的开放染色质,平均每个核24333个片段(n=7)。空间转录数据集平均每个样本包含3874.5个点,每个点包含1,813个基因,变异性很大,主要是由于心肌梗死后细胞死亡的潜在生物学过程。我们使用了一种涵盖所有三种单细胞实验模式的综合数据分析方法来研究心肌细胞特定信息及其在空间环境中的相互作用。
 

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2、Single-cell transcriptome and chromatin landscape revealed heterogeneity of human cardiac cell-types 单细胞转录组和染色质图谱显示人类心脏细胞类型的异质性
为了用snRNA-seq在样本之间建立一致的细胞类型图谱,我们首先分别对每个样本的数据进行聚类,并用文献中经过精选的标记基因对聚类进行注释。为了统一样本之间的细胞类型注释,我们整合和批量校正了来自所有样本的数据,并基于平均基因表达的相关性对它们进行了聚类(图1d)。这种聚类分析揭示了10种主要的细胞类型和几个亚群(总共n=24个簇)(图2),这与最近关于健康人体心脏的文献基本一致。我们接下来对每个样本的snATAC-seq数据进行聚类(图1f)。在从snRNA-seq数据进行标记转移之后,使用最具代表性的标记对snATAC簇进行注释,从而能够在snRNA-seq数据(图1f)中确定的样本中识别出10种主要细胞类型中的8种。在pseudo-bulk ATAC-seq数据中标记基因的启动子可及性证实了细胞类型的同一性(图1g)。我们观察到,在所有snATAC-seq样本合并和批量校正后,细胞类型的一致聚集,并用Hint-ATAC鉴定了细胞类型特异性转录因子结合活性。值得注意的是,虽然大多数标本都存在主要的细胞类型,但不同的细胞类型只在个别标本中被发现,很可能反映了损伤或修复过程中不同的细胞状态。总而言之,我们的综合单细胞分析定义了一个一致的、非冗余的细胞类型目录,这些细胞类型构成了多个模式和样本的成人心脏。
 
我们接下来研究了我们的空间转录数据集是否反映了人类心肌梗死的已知生物学过程。为此,我们使用SPARK鉴定了样本间的差异基因,并使用超几何检验富集生物学过程。这项分析揭示了与潜在生物学条件一致的功能和组织差异(图1h)。急性心肌梗死缺血区,我们观察到空间差异基因主要富集在与先天免疫系统、中性粒细胞脱颗粒、程序性细胞死亡、以及纤维化和肌肉收缩过程的耗尽等条目(图1h)。一直以来,慢性重塑心脏(心肌梗死后晚期)的差异基因富集在细胞外基质(ECM)蛋白多糖、糖蛋白和其他基质组分相关的条目,这与这些标本的预期纤维化过程一致。边界带标本差异基因富集在线粒体复合体I生物发生和丙酮酸代谢/TCA循环等条目,证实了该区域可能发生氧化还原状态和代谢的改变,并对损伤应激反应。在对照样本和偏远区域样本中,我们观察到与肌肉收缩相关的空间变异基因的富集,与这些样本中健康心肌细胞的过度表达有关。总而言之,这一分析证实,空间转录数据能清晰地反映心肌梗死后生物过程的已知区域
 
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3、Integrative multi-omic analysis of the healthy human heart 健康人心脏的多组学综合分析
我们首先的目标是深入描述对照人类心脏样本的综合数据作为参考数据集。我们分别从snRNA-seq(n=8,335)和snATAC-seq(n=3,849)中鉴定出12种细胞类型(图2a-b)。snATAC-seq数据的转录因子(TF)足迹分析发现许多已知的细胞特异性TF的结合活性,如心肌细胞中的MEF2C,巨噬细胞中的ETV6和内皮细胞中的SOX8(图2c)。这些TF的活性通过其靶基因的细胞类型特异性表达进一步得到证实(图2d)。对同一左心室组织的空间转录数据聚类,得到11个不同分子簇(图2e)。差异基因表达分析表明,心肌细胞是独立空间簇的主要转录贡献者(图2e)。值得注意的是,标记基因可以识别不同区域的常见细胞类型,如心肌细胞,但也可以识别罕见的心脏细胞群体,如血管平滑肌细胞(snRNA-seq数据中占细胞的比例小于1%)。有趣的是,肥大细胞(CPA3+)在一个不同的空间簇(簇9,图2e)中被发现,而它们在snRNA-或snATAC-seq数据集中都不能检测到(图2a-b)。对snRNA-seq和空间转录数据集中最高差异表达基因的比较,证实了空间注释(图2e)。
 
然后,我们整合了snRNA-seq和snATAC-seq数据以生成参考数据集,该数据集用于将细胞类型映射到相应的空间转录数据。由于每个空间转录玻片上的单个斑点假定包含多个细胞,我们将标记从整合数据转移到空间基因表达数据,并在每个单独的空间位置映射不同的细胞类型。有趣的是,我们在三个不同的区域(空间簇1、6和7;图2e)观察到三种不同的内皮细胞群体(内皮细胞1-3)。内皮细胞3位于空间簇7(图2E),富含其他类型的细胞,但显示转化生长因子β信号通路活性增加,基于调节组的Smad3活性增加,并与血管平滑肌细胞紧密空间共存(图2f)。这提示了一个空间动脉信号生态位,即内皮细胞3是动脉/小动脉内皮细胞。我们通过染色SEMA3G证实了这一发现SEMA3G是一种内皮细胞特异性标记物,确实染色了被ACTA2阳性的VSMC包围的内皮细胞,表明了动脉的位置。值得注意的是,Litvinukova等人最近还报道了SEMA3G+动脉内皮细胞的存在。
内皮细胞2细胞的定义是高表达Periostin(POSTN),提示为间充质表型,以及可能指示心内膜起源的基因(NPR3和CDH11)。
 
接下来,我们使用MISTy估计了组织中特定细胞类型的空间邻域对其基因表达的影响程度MISTy使用空间上下文视图对细胞类型标记的表达进行建模,例如在检测点本身(内视图)或周围(横视图)中。在这个模型中,在使用空间上下文视图之后,基因表达预测的增加指向了一个点和它的邻居之间的潜在关系。这种关系可能代表组织区域或细胞间相互作用的协调功能。在对内皮细胞标记基因的空间分辨表达进行建模后,我们观察到NPPA、LEPR和INHBA的局部表达预测了内皮细胞2标记基因的表达(图2g)。NPPA以前被描述为心内膜下带的小梁心肌的标志物,因此提示内皮细胞的位置2。为了验证这一假设,我们对人心肌组织中的POSTN和PECAM1进行了多重原位杂交(ISH),证实了PECAM1+/POSTN+细胞在心内膜的明显定位。
接下来,我们模拟了两个成纤维细胞亚群成纤维细胞1+2(图2h)的空间分辨表达,并确定了几种解释成纤维细胞2位置的细胞因子。有趣的是,该模型揭示了与巨噬细胞亚型2相关的IL13RA1的局部表达,预测了成纤维细胞2标记FBN1的表达,这表明特定的成纤维细胞亚群和巨噬细胞之间在心脏稳态中存在潜在的信号传递(图2h)。
  
4、Demarcation of the ischemic zone visualized by distinct gene expression and regulation基因表达与调控差异对缺血区划分的可视化研究
我们接下来调查了严重梗死后2-5天收集的急性人类心肌梗死组织的缺血区标本(图3A-B)。snRNA-seq和snATAC-seq显示细胞捕获率降低,这是由于缺血相关细胞死亡的潜在生物学过程(图1h)。我们在这些数据集中确定了四种不同的细胞类型。从空间基因表达分析中,我们能够从这个部分坏死的区域产生数据,在一些位置每个点有超过8000个基因。空间转录组数据的聚类显示出与对照心脏相比的独特模式,并以梗死组织区为界(图3a)。我们在标本的中心(图3a,右图)确定了一个核心缺血区(空间簇3),周围是苏木素和伊红染色的玻片中可检测到的嗜碱性区域(图3a,左图)。提示中性粒细胞浸润前沿是无灌注心肌梗死的典型分界。缺血区周围可见中性粒细胞浸润的前缘,呈8簇分布,主要中性粒细胞标志物(NCF1,ALOX5AP)表达。我们进一步检测到CXCL8表达的强梯度(簇2),这是一种众所周知的中性粒细胞趋化因子(图3b)。样本中心严重受损的分界区(簇3)被不同基因表达的同心簇包围(图3a-b)。值得注意的是,与其他心脏样本相比,在这一区域检测到的基因总数减少了,这与该缺血区预期的细胞死亡情况一致,并解释了为什么snRNA和snATAC数据只能恢复几种细胞类型TNNI3(肌钙蛋白)是一种典型的心肌细胞标志物基因,在标本左侧的存活心肌中被检测到(图3b)。NPPB基因的表达,编码了广泛使用的心力衰竭生物标记物脑钠素(BNP),表明了一个应激存活心肌细胞的空间区。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达区指向强烈的巨噬细胞浸润,COL3A1表达区的不同表明存在早期激活的成纤维细胞(图3b)。我们发现S100A1在缺氧信号增加区域附近的邻接表达具有很高的重要性(图3c-d)。S100A1是一种钙结合蛋白,与心肌细胞中的收缩器相互作用,已被证明可以提高心肌梗死后心肌细胞的收缩能力。低氧信号活性在坏死区周围最高,这可以用表达低氧反应基因的活细胞的丰富来解释(图3d)。除了CXCL8,我们还观察到ANGPTL4和AREG的表达是不同空间区的重要预测因子。ANGPTL4是已知的心脏修复中巨噬细胞极化的促进器,AREG是一种被报道在心脏缺血中具有保护作用的生长因子。此外,我们发现,S100A1的局部表达一致地预测了两种缺血切片中心肌细胞标志物的表达(图3c)。
 
为了探索与空间区域相关的TF,我们使用细胞类型分数将TF结合活性从snATACseq数据映射到空间。我们观察到局部NRF-1结合活性增加,这也显示出高缺氧信号(图3d)和胶原表达(图3b)。然后,我们证实了空间TF结合活性与特定NRF1靶基因的表达相对应。NRF-1调节呼吸链亚单位编码基因和线粒体功能相关基因的表达,与细胞对缺氧的反应一致。
第二个急性心肌梗死标本中缺血区的空间转录数据显示出相似的界限。与同一心脏标本的偏远区域相比,这些区域的预测特征是保守的。有趣的是,我们观察到在缺血区(第2组)有EGFL7和Sox4表达的新生血管生成的早期迹象,以及显示ER应激标志物基因表达的空间心肌细胞组,如HERPUD1(第4组)。综上所述,这些数据表明,对缺血相关细胞死亡的反应有明显的空间基因调控,而基因调控驱动着急性心脏损伤反应
 
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5、Spatially distinct cardiomyocyte subpopulations in the border zone交界区心肌细胞亚群的空间分布
心肌梗死的边缘地带尤其令人感兴趣,因为该区域的空间重构与心功能的恢复有着千丝万缕的联系。尽管苏木精和伊红染色均匀,UMI分布在玻片上(图4a),但我们观察到了广泛的异质性空间基因表达,并在样本中心(簇1)确定了一个特定的空间过渡区(图4a)。这个区域将样本的左上角和右下角的不同基因表达区域分开(图4a)。我们从snRNA-seq(n=6,081)中鉴定出13种细胞类型,从snATAC-seq(n=3,101)中鉴定出8种细胞类型(图4b-c)。有趣的是,两组数据都确定了两个不同的心肌细胞群体(心肌细胞1和2)(图4b-c)。心肌细胞1仅位于移行区(损伤区)以下,心肌细胞2主要位于移行区之上(图4d)。snRNA-seq数据中的差异基因表达分析显示,NPPB、ANKRD1和MYO18B在心肌细胞1中显著上调(图4d)。NPPB和ANKRD1这两个基因都曾报道过在MI后的边界区上调表达。空间基因表达数据的通路分析表明,在损伤区域(右下角)TGFβ活性增加,同时我们发现缺氧活性的均匀分布(图4d)。
snATAC-seq数据的足迹分析表明,心肌细胞1和2都具有已知的心肌细胞系特异性TF的高结合活性,如GATA4、MEF2C和MYOD1,而心肌细胞1显示NFE2L1的结合活性增加(图4e-f)。NFE2L1调节各种各样的细胞反应,其中几个与保护机体免受缺血刺激有关。重要的是,我们观察到与心肌细胞2相比,心肌细胞1中与应激和炎症相关的转录因子如Smad2/3、Jun、FOS(AP-1信号)的结合活性增加(图4e)。有趣的是,心肌细胞1的这些基因调控程序与心脏成纤维细胞部分共享(图4e)。MEF2到AP-1驱动的基因程序的整体切换之前已经在小鼠MI的边界区的文中描述过。TF结合活性的空间定位表明GATA4 TF结合活性在心肌细胞2位置,而NFE2L1和RUNX2与心肌细胞1和成纤维细胞1位置相关,我们通过分析它们细胞类型特异性靶基因的空间表达证实了这一点(图4g-h)。
 
为了进一步研究区分这些心肌细胞类型的顺式调控相互作用,我们通过整合snATAC-和snRNA-seq数据检测了峰到基因的联系。接下来,我们确定了心肌细胞1或2群体中具有最高数量链接的基因。与心肌细胞2相比,ANKRD1是心肌细胞1中峰值基因连接最显著升高的基因之一。有趣的是,我们在ANKRD1启动子位点上游的心肌细胞1特异性峰中检测到两个足迹支持的NFE2L1结合位点(图4i)。此外,这些区域的高H3K4me1信号支持心肌细胞中这些顺式调节元件的增强功能(图4i)。这些结果表明NFE2L1在心肌细胞1中直接调控ANKRD1。此外,我们还在COL1A1和CREB3L2基因的增强子区域发现了NFE2L1的足迹,并在COL1A1和CREB3L2基因的增强子区域发现了NFE2L1的结合位点。有趣的是,我们还观察到几种细胞因子与这些心肌细胞亚型的位置有关。在对心肌细胞标记基因的空间分辨表达进行建模后,我们观察到CCR2的局部表达预测了心肌细胞1标记基因在标本损伤区域的表达(图4j)。据报道,CCR2+驻留的心脏巨噬细胞是心肌损伤炎症反应的关键调节细胞。有趣的是,CCR2对于预测成纤维细胞1的定位以及暗示潜在互作的TGFβ2通路活性也特别重要。第二个边界区域样本总体上显示出类似的发现。
综上所述,分析表明在交界区有不同的基因表达和调控,心肌细胞亚群位于不同的损伤、炎症和重塑区域
 
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(原文图4)
 
6、Remodeling of the myocardium post-MI 心肌梗死后的心肌重构
心肌梗死后瘢痕的形成对心脏组织的完整性很重要,因为瘢痕形成失败会导致心室破裂和死亡。一个慢性重塑的标本有两个可见的疤痕,其中一个位于中央,形成一个U形(图5a,箭头),第二个位于标本右上角(图5a,箭头)。空间转录数据的聚类显示,这两个瘢痕排列成不同的簇(簇2和簇9),并被反映新血管生成的更大面积的内皮细胞分开(图5a)。我们从snRNA-seq(n=2,869)和snATAC-seq(n=1,605)中鉴定出不同的成纤维细胞和内皮细胞亚群,它们在这两个瘢痕上显示了有趣的空间分布(图5b-c)。
snRNA和snATAC与空间转录的整合使我们能够提高空间分辨率,显示成纤维细胞3在中央瘢痕内占主导地位,并与内皮细胞1占主导地位的区域有明显的边界(图5d)。这一区域被一个周细胞增多的区域所包围,该区域也指向瘢痕周围的新生血管生成(图5d)。有趣的是,成纤维细胞5主要存在于载玻片右上角的瘢痕中,周围环绕着内皮细胞5(图5c)。与中央瘢痕相比,这个瘢痕显示较少的细胞外基质(ECM)表达,这可能代表了瘢痕形成的不同阶段(图5d)。值得注意的是,snRNA-seq和空间转录组数据仅鉴定了一小部分心肌细胞(图5c-d),这与心肌梗死后替代瘢痕的形成相一致。空间特征的差异分析显示,在成纤维细胞3富集的区域(空间簇2),JAK-STAT和TGFβ活性增加,这两条都是纤维化重塑的重要途径。富含成纤维细胞5的区域也包含受损的内皮细胞和增加的缺氧途径活性(图5d)。我们观察到TGFβ3、PDGFRA和PDGFA的局部表达是预测成纤维细胞3存在的重要指标,成纤维细胞3大量存在于中央瘢痕区域(图5e-f)。SERPINE1(PAI-1)与组织中的活动瘢痕形成相关,在第9簇中显示出很高的重要性,并与较高的缺氧和VEGF-A信号有关(图5e-f)。相反,中央瘢痕区域(空间簇9)也与较高的NRF-1和TF-FOS结合活性有关(图5h)。我们用平行的snATACseq数据进一步验证了这一点,该数据表明在TGFβ途径的下游有更高的Smad2/3结合活性。总而言之,这些数据表明,两个瘢痕区域之间存在时间上的差异,表现为较年轻的瘢痕(右上)具有强烈的缺氧信号和明显的成纤维细胞亚群,中心有一个较老的慢性大型瘢痕,涉及FOS、Smad2/3、NRF1和RUNX1的高基质产生。这一发现也得到了第二个慢性数据集中成纤维细胞1处较高的空间RUNX1活性的支持
由于纤维化反应和瘢痕形成是晚期心肌梗死重构的主要特征,并与心脏僵硬、收缩和舒张功能下降以及引发电不稳定有关,我们接下来要问在心肌纤维化中成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的机制是什么
 
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(原文图5)
 
7、Trajectory analysis revealed RUNX1 as a regulator of myofibroblast differentiation in the human heart 轨迹分析显示RUNX1是人类心脏肌成纤维细胞分化的调节因子
为了剖析肌成纤维细胞分化的机制,我们从整合的snRNA-seq数据集中对所有成纤维细胞进行了重新聚类,并确定了9个亚类(图6a),这表明心脏间质存在未被认可的异质性。拟时序分析表明,起源于簇3并终止于簇1的整合成纤维细胞存在分化梯度(图6a)。我们最近发现SCARA5是人类肾脏成纤维细胞的标志物,并证明了SCARA5+成纤维细胞是肾脏肌成纤维细胞的来源之一。因此,我们在拟时序分析中使用了SCARA5表达最高的细胞(簇3)作为根细胞Periostin(POSTN)是肌成纤维细胞分化的标志,似乎在人和鼠之间是保守的,并且在肾脏纤维化中也起着作用。与SCARA5+簇3(图6b-c)相比,簇1显示了POSTN,COL1A1和FN1的最高表达以及胶原蛋白的丰富(Naba胶原评分),这表明了一个终末分化的肌成纤维细胞群体。轨迹分析推测SCARA5+细胞向POSTN+细胞分化的轨迹符合我们的假设。这一数据表明,在肌成纤维细胞分化过程中,SCARA5和PCOLCE2等基因下调,ECM基因和矮小相关转录因子1(RUNX1)的表达增加(图6d)。为了了解成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的机制,我们接下来沿着这条拟时序轨迹对基因、通路和Go-Term(基因本体)进行了分类,这证明了整合素信号和ECM通路的晚期富集与成纤维细胞到肌成纤维细胞的分化是一致的。有趣的是,其中一些发现,包括SCARA5和PCOLCE2在成纤维细胞到肌成纤维细胞分化中的表达降低,似乎在不同的器官之间是保守的,因为我们在人类肾脏中也观察到了这一点。正如我们的拟时序分析所表明的那样,我们通过与人心脏组织中的泛纤维细胞/肌成纤维细胞标记COL15A1+(图6e)共染色,证实了SCARA5+在成纤维细胞中的高表达。轨迹的方向进一步被POSTN+,COL1A1+肌成纤维细胞在人类心力衰竭患者纤维化心脏组织中的积累所证实(图6f)。
 
我们使用snATAC-seq数据进一步验证了这种分化轨迹。所有成纤维细胞的亚群确定了11个不同的群体。接下来,我们使用ArchR38(图6g-h)将轨迹从snRNA-seq映射到snATAC-seq。重要的是,我们还在扩散图的不同端观察到了高度可及的POSTN和SCARA5启动子区域的细胞(图6g-h)。为了确定调节这一过程的TF,我们沿着轨迹整合了基因得分和TF基序活性,并确定了几个TF,它们显示了基因可及性和轨迹上的基序活性之间的显著相关(图6i)。我们观察到Hedgehog转录因子Gli2沿成纤维细胞肌成纤维细胞分化轨迹基因可及性和基序活性增加,这与我们报道的Gli2在调节肌成纤维细胞扩张中的作用是一致的。我们还观察到Smad1活性和可及性的增加(图6j),这是TGFβ信号的下游转铁蛋白,是肌成纤维细胞分化的标志途径之一。有趣的是,我们观察到RUNX1和RUNX2也显示出从成纤维细胞到肌成纤维细胞分化的基因可及性和基序活性增加(图6k)。据报道,RUNX1与SMAD蛋白物理上相互作用,从而直接传递TGFβ信号。我们的时间TF分析表明,Smad1在RUNX1(图6i)之前被越来越多的激活,这进一步得到了空间共定位的RUNX1TF结合活性和转化生长因子β信号(图6l-m)和RUNX1/Smad1共结合基序分析的支持。RUNX1在心肌细胞中的作用已被初步研究过,在心肌细胞中缺乏RUNX1可以保护心肌免受缺血性损伤。在心脏中,RUNX1在非心肌细胞中的作用尚未详细确定,但最近的一项研究报道,RUNX1结合基序是心脏成纤维细胞特异性活性增强剂的主要基序。
 
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(原文图6)

为了验证RUNX1在肌成纤维细胞分化中的潜在作用,我们通过流式细胞仪、慢病毒SV40LT和HTERT端粒酶逆转录酶转导技术建立了人心脏PDGFR+成纤维细胞。有趣的是,慢病毒过表达RUNX1增加了TGFβ诱导的肌成纤维细胞分化,增加了COL1A1、ACTA2和FN1的表达(图6n)。因此,我们的数据表明RUNX1是肌成纤维细胞分化的重要驱动因子,并且通过放大TGFβ信号发挥作用。结合已知的RUNX1在心肌细胞中的作用,该转铁蛋白可能成为治疗心肌梗死后心脏重塑的一个非常有前景的靶点。
 
 
讨论
在多细胞器官中,如人类心脏,细胞功能依赖于相邻个体细胞类型之间相互作用的平衡,从而导致组织内稳态。单细胞技术可以描绘不同细胞类型的分子异质性及其在疾病过程中的变化。然而,在没有空间背景的情况下,这些不同类型的细胞如何协调组织功能是不清楚的。在这里,我们提供了与对照心脏(未移植的供体心脏)相比,MI后早期和晚期人类心脏的综合资源图,整合了空间转录与单细胞基因表达和染色质可及性数据。空间转录学数据的使用使我们能够研究细胞谱系和功能之间的联系,这是单靠单细胞技术无法实现的。我们提出了一个计算框架来整合每个患者的多组学数据集。我们跨样本关联细胞类型,以实现细胞类型注释的高度一致性。我们通过将细胞类型映射到特定位置来提高空间转录的分辨率。此外,我们还提供了捕获信号和转录调控的本地生物过程的目录事件。我们的发现提供了有关心肌细胞类型及其对人类心脏缺血性损伤的反应的详细见解。我们观察到,在细胞因子区域表达的引导下,随着免疫细胞群体的区域涌入,梗死区的早期划分,受损心肌周围的边界确实显示了受损和非受损细胞类型之间的清晰边界。不同位置的心肌细胞在边界上表现出不同的基因表达模式和基因调控谱,包括增强子的可及性。心肌梗死后晚期的重塑是由纤维化和成纤维细胞向肌成纤维细胞分化驱动的,瘢痕明显,周围有新生血管生成。我们的数据为心肌梗死后人类心脏肌成纤维细胞分化提供了新的见解,不同的基因表达和基因调控程序推动了这一过程,包括作为TGFβ信号放大器的RUNX1。
我们预计我们的工作将为未来将单细胞基因组学与空间基因表达数据相结合的研究提供参考。此外,我们相信我们的数据将有助于理解人类心肌内的空间基因表达和基因调控网络,并将成为未来旨在了解不同类型的心肌细胞在心脏稳态和缺血性疾病中的功能的资源。
 
最后,再介绍一个最新的技术:

空间代谢组质谱成像技术
空间代谢组学(Spatial Metabolomics),是研究小分子代谢物在组织切片中的空间分布,告诉我们变化「在哪里发生」,从而极大拓展了人们对组学样品信息的认知。
空间转录组+单细胞测序+单细胞ATAC+空间代谢组,等多组学联合应用,能在单细胞和μmm分辨率下研究基因的表达和代谢产物的空间分布,是肿瘤代谢、生长发育等方向的研究利器,预测将是下一个高分文章热点
 
【创新模板】将空间单细胞多组学技术应用到研究,特别适合大咖进行探索性研究
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原文全文链接:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.08.411686v1.full.pdf

编辑:Henry,微信号:Healsan。公众号“BioMed科研随笔”和作者Grayson。

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