新冠患者“复阳”,是病毒的遗传物质插入他们的基因组?

新冠患者“复阳”,是病毒的遗传物质插入他们的基因组?

作者:令页

编辑:小怡

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目前,新冠病毒仍在全球肆虐,并且时有报道,新冠患者康复后存在“复阳”现象,搞得人心惶惶。

最近,来自MIT怀特黑德生物医学研究所的Rudolf Jaenisch团队在预印本平台bioRxiv发表文章,阐述了新冠“复阳”的一种可能性解释:新冠病毒(SARS-CoV-2)的部分核酸序列可以整合到人体基因组中,随之转录,导致核酸PCR检测呈阳性(复阳)。

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研究背景

有报道称,新冠患者在康复数周或数月后出现连续或反复的复阳(SARS-CoV-2 PCR阳性)。

对新冠康复受试者进行严格的隔离证明,复阳病例并非由再次感染引起。也未从复阳患者中分离出有复制能力的病毒。

作为正链RNA病毒,SARS-CoV-2利用RNA依赖的RNA聚合酶复制其基因组RNA,并转录其亚基因组RNA。一种假设是SARS-CoV-2 RNAs可以被逆转录并整合到人类基因组中,而整合DNA拷贝的转录可能是PCR检测阳性的原因。

内源性逆转录酶(RT)活性已在人类细胞中被观察到,并且逆转录的产物已被证明可以整合到基因组中。人LINE-1元件(约占人类基因组的17%)是一种自主逆转录转座子,是内源性RT的潜在来源,能够逆转录转座子自身和其他非自主元件。

基于上述理论和假设,研究人员开展以下研究。

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研究内容与结果

为了研究病毒遗传物质整合到感染细胞中的可能性,研究人员分析了已发表的SARS-CoV-2感染细胞的RNA-Seq数据,发现大量宿主病毒整合序列。

这些发生在多种样本类型中,包括来自肺/心/脑/胃组织的细胞和器官,以及直接从COVID-19患者分离的BALF(肺泡灌洗液)细胞。

嵌合Read丰度与样本中的病毒RNA水平呈正相关。整合reads通常占样本中SARS-CoV-2总reads的0.004%-0.14%,来自重症COVID19患者支气管肺泡灌洗液细胞的最大reads数则能达到69.24%。

且大多数新冠病毒的整合序列都来自于核衣壳(N),与核衣壳RNA是新冠病毒亚基因组中最丰富的RNA相一致,因此最有可能成为反转录和整合的目标

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为了对SARS-CoV-2 RNA的逆转录和整合提供实验证据,研究人员在HEK293T细胞中过表达人LINE-1或HIV-1逆转录酶(RT),并用SARS-CoV-2感染转导细胞。

感染后2天对细胞进行PCR或FISH实验检测到病毒序列。由CMV启动子驱动的LINE-1强表达的细胞表现出比由其自然启动子(5'UTR)或HIV-1 RT驱动的LINE-1细胞高约8倍的N序列检测信号,表明嵌合N序列的复制数更高。

从CMV-LINE-1过表达的细胞gDNA中克隆了全长核衣壳DNA,并通过Sanger测序确定了其序列。使用荧光团标记的以N为靶点的寡核苷酸探针进行单分子RNA-FISH分析,确认病毒N序列已整合并检测到其在细胞核中的转录。感染SARS-CoV-2但未转染的细胞也表现N信号,尽管频率较低(约10%),提示SARS-CoV-2 核衣壳RNA通过细胞内源性RT酶活性整合。

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LINE-1反转录转座子在基因组DNA中占高,但活性低,为了证明新冠病毒整合进人体基因组确实和LINE-1反转录转座子相关,研究人员对已发表的SARS-CoV-2感染后的细胞RNA-Seq数据统计分析。发现感染患者的LINE-1的表达显著上调,并与整合序列的丰度相关。 

利用LINE-1特异性引物进行表达分析显示,SARS-CoV-2感染Calu3细胞后,LINE-1表达上调了约3-4倍。

此外,对Calu3细胞DNA的PCR分析显示,感染后SARS-CoV-2 N序列发生了整合,可能是通过激活的LINE-1逆转录酶实现的。

感染SARS-CoV-2的患者显示出与免疫反应相关的诱导细胞因子的证据,并且在严重的病例中经历了细胞因子风暴,这促使研究人员研究单独的细胞因子是否能诱导LINE-1的激活。

研究人员用含有细胞因子的条件培养基处理来自髓系、小胶质细胞或CAR-T细胞培养的细胞,通过PCR分析发现内源性LINE-1表达上调了约2-3倍。免疫荧光染色证实表达了LINE-1蛋白(ORF1p)。

综上,病毒感染或暴露于细胞因子的细胞中诱导了LINE-1的表达,提示了人类细胞中SARS-CoV-2逆转录整合的分子机制。

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小  结

对于本研究结论,业界存在一些争议。比如,有研究者认为“数据库中的嵌合转录本证据不足,且体外过表达实验不能够代表体内真实结果”、“未展示跨越整合部位的基因组序列和靶点重复以及poly-A尾巴”、“没有证明LINE-1插入的是DNA”等。

科学就是被用来被反复验证和怀疑的,只有坚持这种态度,科技才能进步、社会才能发展,愿人类早日攻克新冠病毒,恢复往日生机。

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