PCR引物如何设计

“小胡,老板让我跑一下PCR,具体我要订什么呀?”

“引物订了吗?”

“没有呀,怎么订?”

说起Real-Time PCR,大家都不陌生,毕竟是检测基因转录水平表达情况最基本的实验了。但是对于没有接触过的小伙伴来说,还是挺陌生的,所需试剂仪器就先不聊了,今天小编单就lncRNA/mRNA引物设计来说道说道。

拿到一个指标,我们首先通过NCBI的gene查询有几个转录本。只有一个转录本的话,一切好说,直接拿序列。若存在多个转录本,而要检测的是目的指标的总的转录表达水平(不考虑剪接变异体)时,一般会取该指标的所有转录本的公共序列进行设计引物(如果没有公共序列,则针对表达量最丰富的转录本进行设计)。当我们想检测一个指标的不同转录本的表达情况时,这就要单独对转录本的特有部分进行设计了。

说了这么多,那引物到底怎么设计的呀?

总的来说,我们一般主要从4方面获取,文献查询PrimerBank自己设计外包公司设计

1.     文献查询

我们把自己的指标输入pubmed,然后着重看文章的材料方法部分。如果该文章进行了real time PCR实验的话,那么在材料方法区域会单独作为实验的一个分支标注出来(如下图)。有的会提示引物序列具体见附表,有的则直接在材料方法给出,这样就可以轻松得到引物序列啦。

注:Real-time PCR一般缩写为 qPCR(quantitative real-time PCR),两者表达意思一致。

当然,文献可供选择的引物有很多,但是尽量选择高分文献,毕竟可信度较高,IF不是说说而已的。

2.     PrimerBank

如其名,这是一个储存引物的数据库  (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) ,目前提供人和鼠两个物种。具体操作很简单,这里输入基因官方名称后提交。

结果会显示具体针对哪个转录本设计,引物长度,扩增产物长度,具体位置等。但是缺点是不能看到参考文献,所以无从知道引物来自几分文献,所以拿到引物后尽量评价后再进行使用。具体评价引物质量的数据库,咱们之前也介绍过了,大家根据那个操作即可。

3.     自己设计

(1)     在线设计

可供在线设计的数据库相当多,这里我们以NCBI的Primer-BLAST为例,简要介绍一下使用方法。首先通过该数据库链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/打开首页,当然我们也可以从NCBI主页面的下方导航栏进入(如下图)。

NCBI下载目的RNA的碱基序列(部分或全部序列)放入Primer-BLAST,或者输入基因,按下图所示操作进行后,点击Get Primers。

然后会跳转至以下界面。

结果主要包含两个方面

一般会设计10个引物

Graphical view of primer pairs

以图表形式显示扩增产物的长度及位置(因为上述小编没有选择跨外显子,所以下图中的引物位置没有跨外显子)

Detailed primer reports

包含引物的详细信息,如引物长度,开始结束位置,扩增产物长度,引物自身互补性等。

当我们有一对引物,想查询其扩增产物长度及特异性时,也可以使用Primer-BLAST

粘贴引物后,点击Get Primers。将会得到该引物的详细信息。根据下图,可以发现该引物没有非特性性扩增。

(2)     专业软件设计

例如Oligo,这里就暂不过多赘述了,具体使用方法,网上教程很多。

4.     公司设计

当我们通过以上几种方法得到的引物效果均不理想时,就找公司吧,具体操作:打钱就是啦。

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