肝组织转录组深度测序揭示HBV DNA整合的广泛表达

摘要

      乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)与肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的发生密切相关。HBV整合入人类基因组对癌症发生和HBsAg的产生具有重要作用,但是HBV整合对血清HBsAg水平的影响仍不清楚。本文作者通过转录组深度测序描述了慢性HBV感染合并或不合并HDV感染患者肝组织中HBV整合的HBV RNA谱。结果显示,几乎所有的HBV RNA图谱在核心区和3′冗余区(nt 1830-1927)都没有reads,并含有大量的病毒/人融合转录本(fusion transcripts)。据此可以认为,在晚期HBV感染中,尤其是在HDV合并感染的病例中,肝组织中的病毒转录组以整合型HBV DNA而非共价闭合环状DNA(cccDNA)为主。这些发现支持了整合的HBV DNA可能是部分患者HBsAg的重要来源的观点。

HBV RNA图谱结果

       作者依据整合源性HBV RNA转录本缺乏编码核心抗原的5′部分、并在nt 1830或稍上游结束的特点,来鉴别cccDNA源性和整合源性的HBV RNA(图1)。五位肝移植患者中,患者1血清中HBV DNA水平相对较高(5.55 log IU/mL),转录组的核心区覆盖率中等,但S区和X区覆盖率10倍于核心区覆盖率,据此认为90%以上的含S和X序列的RNA来自整合HBV DNA片段。患者2在替诺福韦治疗4个月后,血清中HBV DNA水平较低(2.09 log IU/mL)。非肿瘤组织中HBV总reads较低,核心区覆盖率与S区和X区相似,说明RNA来源于cccDNA。相比之下,肿瘤组织显示出较高的HBV覆盖率(316 033个读数),并且S和X区的深度比核心区大1000倍,这表明肿瘤组织中没有HBV复制,但S和X区RNA的大量转录提示其来自整合的HBV DNA。3、4、5例患者接受替诺福韦或恩替卡韦治疗至少两年,在终末期HBV诱导的肝硬化患者3中,仅检测到238个HBV RNA reads,全部位于S和X区,表明HBV转录非常低,据此推测主要转录自整合HBV DNA片段。第4、5例合并HDV,两患者血清中均未检测到HBV DNA,但HBsAg水平较高。其肝组织转录本>99%位于S和X区(表1)。

表1  5名患者肝切除组织RNA深度测序特征与结果

图1 来自肝硬化、肝细胞癌患者肝切除组织的RNA深度测序数据。蓝色的为HBV RNA reads的覆盖率,柱形图代表整合位点以及融合基因reads数量。


对来自ICGC的数据也显示,21个患者的核心区reads低并且缺少nt 1830到1930的reads,表明RNA来自HBV的整合,计算推测整合来源的RNA占95%。在RK126患者的非肿瘤样本中发现了不同的表达谱(图2D),其中HBV表达于前S2区和S区,直到病毒的第454位核苷酸(nt)。该位点是大量reads携带了GTF2I基因转录本中的HBV-人类基因融合位点。

融合基因以及整合对临近基因的影响

对病毒、人融合转录本序列的分析结果显示,超过99%的融合基因都由HBV 3′部分和人类基因3′部分组成。无论是来自五名患者样本还是ICGC数据,都表明大部分融合基因中的5′端的HBV部分在nt 1750-1830结束,下游连接人类序列。虽然大部分样本融合基因的reads数量和比例都不高(5名肝移植患者的切除组织样本融合片段占比在0~7%,ICGC样本融合片段占比在0~18%),但是HBV诱导的HCC(患者2)肿瘤组织中发现同一个位点处包含大量融合基因reads表明,该整合可能与肿瘤的发生发展有关。
为了探讨HBV整合对人类基因表达的潜在影响,作者将样本中的RNA数据与未感染HBV的健康人肝脏组织的mRNA数据进行了比较。结果表明,大多数整合发生在内含子或基因间区,对人类基因表达无显著影响,只有12%整合存在于外显子。其中患者2的肿瘤样本中TERT的表达增加了约1000倍,结合融合片段结果,表明该位点整合可能上调了TERT的表达进而诱发HCC。在12个HBV整合的人类基因中,有8个基因过度表达,1个基因没有变化,3个基因表达下降。ICGC数据在一个肿瘤样本(RK010)中发现了HBV在TERT中的整合。在5个肿瘤样本中,与肝癌密切相关的MLL4(KMT2B)中也发现了HBV整合,与先前研究结果一致。

图2 来自ICGC数据库中21个患者的HBV RNA reads映射至HBV参考基因组的序列。B-E选取了其中两个患者肿瘤或非肿瘤组织的数据。


HBV剪接与重组片段

在7个组织样本中,有6个发现了HBV RNA剪接形式,但不到总HBV RNA的1%。最常见的剪接显示末端连接在nt 2067和nt 489之间,病人2的肿瘤样本中有>2000个这样的reads。第二常见的是nt 2985-489,在患者1中有55个reads。在ICGC数据中发现的超过1 500 000 reads中,只有306个reads的剪接发生在先前报道的HBV剪接供者/受体位点,其中最常见的是nt458-489连接(总共28个reads)。总的来说,这些剪接体只占所有HBV reads的3%,而整合所致HBV DNA重组或缺失的RNA reads明显多于剪接形式的RNA reads。

总结与讨论

本研究提供了覆盖整个HBV基因组的RNA图谱,定量估计了整合程度,展示了HBV整合位点和HBV转录组图谱之间的强烈空间联系。结果表明,在晚期HBV慢性感染患者和合并HDV感染的患者中,整合的HBV DNA是血清HBsAg的重要来源,同时在人类患者中首次观察到HDV对整合来源的HBsAg的利用。此外,在对融合基因以及人类基因变化的分析中揭示了HBV整合与HCC发生发展的相关性。本研究的生物信息学流程也在检测fusion reads方面比以前的方法更为敏感,发现了许多新的HBV整合,为以后检测提供了新思路。

文献来源: 

Ringlander J, Skoglund C, Prakash K, et al. Deep sequencing of liver explant transcriptomes reveals extensive expression from integrated hepatitis B virus DNA. J Viral Hepat. 2020;27(11):1162-1170. doi:10.1111/jvh.13356.

文字:袁荻森

编辑:顾智强

校对:许梓萌

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