唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究

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唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究

摘  要目的  响应面设计制备唾液酸(sialic acidSA)修饰的绿原酸(chlorogenic acidCA)脂质体(CA-SAL),考察其体外细胞毒性和摄取。方法 采用改良逆相乙醇注入法制备CA-SAL,以葡聚糖凝胶G-50柱离心法分离脂质体和游离药物,并通过HPLC法测定药物质量浓度,计算包封率。以包封率和载药量为考察指标,通过Box-Behnken响应面设计实验优化CA-SAL的处方和工艺,MTT法评价其对人肺癌A549细胞的细胞毒性,倒置荧光显微镜观察A549细胞对CA-SAL的摄取情况。结果  优化后的CA-SAL制备条件:氢化大豆磷脂与绿原酸的质量比为151,水化温度60 ℃,超声功率400 WCA-SAL平均粒径为(90.13±0.51nm,多分散指数(PDI)为0.16±0.01Zeta电位为(−25.3±0.5mV;包封率为57.8%RSD0.1%MTT实验结果显示,CA-SALA549细胞的增殖抑制作用显著强于绿原酸脂质体(CA-CL),细胞摄取实验表明A549细胞对唾液酸修饰脂质体的摄取更高。结论 通过响应面优化制备的CA-SAL粒径小、性质稳定。经唾液酸修饰后的脂质体可以增强人肺癌A549细胞的细胞摄取及体外细胞毒性。

绿原酸(chlorogenic acidCA)是金银花、杜仲等药材的重要活性成分[1-3],是由反式肉桂酸与奎尼酸组成的多酚类化合物,具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗紫外光与辐射、免疫调节、调血脂、降血糖等药理作用[4-6],具有重要应用开发前景。但绿原酸为极性有机酸,受热见光易氧化,结构不稳定,生物利用度低[7-8]。纳米脂质体作为药物载体具有良好的生物相容性[9],脂质体包裹的药物可以有效地防止药物氧化、提高药物光稳定性和体内的吸收[10]。脂质体包载绿原酸可以克服绿原酸的不稳定和难以透过细胞膜的不足,通过高渗透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effectEPR)增加其靶向性,降低了治疗剂量进而提高其体内生物利用度[11-12]。近年来唾液酸(sialic acidSA)的结合蛋白相继被发现,其中Siglec-1又被称为唾液酸黏附素[13],在巨噬细胞促炎症反应中起着重要作用,已有研究表明其在肿瘤相关巨噬细胞表面高表达[14],在肿瘤靶向治疗中可作为抗肿瘤药物的靶[15],将唾液酸修饰在脂质体上,增加制剂靶向效果,可以更好地发挥疗效。

本实验采用改良逆相乙醇注入法制备唾液酸修饰绿原酸脂质体(sialic acid modified chlorogenic acid liposomesCA-SAL),通过响应面设计优化处方制剂工艺,对其形态、粒径及其分布和包封率进行评价,并进一步通过细胞毒性和细胞摄取实验考察了唾液酸修饰绿原酸脂质体的体外抗肿瘤活性。

1  仪器与材料

1.1  仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,杭州博研仪器设备有限公司;Agilent1200型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;艾本德5810R台式离心机,德国Eppendorf有限公司;超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技有限公司;UV-vis2450紫外分光光度计,日本Shimadzu有限公司;XS105分析天平,梅特勒-托利多有限公司;Nano-zs90激光粒度Zeta电势测定仪,英国马尔文仪器有限公司;DS-Ri2荧光倒置显微镜,日本Nikon有限公司;Infinite 200多功能酶标仪,瑞士帝肯有限公司;Nicolet IS50红外光谱仪,赛默飞世尔科技公司;Avance II600MHz核磁共振波谱仪,瑞士布鲁克有限公司。

1.2  材料

氢化大豆磷脂(HSPC,批号B60455)、胆固醇(Cho,批号B80859)、双饱和卵磷脂(DSPC,批号B51276),注射级,上海艾伟拓医药有限公司;大豆卵磷脂(SPC,批号8002435),诺维博美医药科技有限公司;蛋黄卵磷脂(EPC,上海源叶生物科技有限公司,批号T18A9F58540);绿原酸原料药,批号N1904131664,质量分数>98%,上海乔羽生物有限公司;香豆素6C6,上海源叶生物科技有限公司,HPLC级,批号Z14M10H88284);透析袋MWCO3500-4000(上海源叶生物有限公司);葡聚糖凝胶G-50(批号C10692375)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,批号C10476444)、N-羟基琥珀酰亚胺NHS,批号C10490891),上海麦克林生化科技有限公司;十八胺(ODA,批号FY28643H9410),南通飞宇生物科技有限公司;MTT试剂盒(批号A100793-0001)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,批号E607303),生工生物工程(上海)股份有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF,批号20180820),广东光华科技股份有限公司;无水乙醇为分析纯;甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯。

2  方法与结果

2.1  SA-ODA的合成[16]

室温下使用DMF 10 mL溶解唾液酸184 mg0.60 mmol),之后加入NHS 140 mgEDC·HCl 228 mg,室温下磁力搅拌1 h进行活化。活化完成后向反应体系中加入ODA 54 mg0.20 mmol),氮气保护下60 ℃、240 r/min搅拌12 h。反应完成后用超纯水将反应体系稀释至4倍体积,并使用超纯水进行充分透析(截留相对分子质量3 500),冻干得SA-ODA纯品。唾液酸和SA-ODA傅里叶变换红外光谱(FT-IR)见图1SA-ODA核磁共振氢谱(1H-NMR)见图2。通过图12 9182 850 cm−1处烷基和1 1171 030 cm−1处醇羟基的存在以及随着1 7251 756 cm−1处羧酸基团的消失,验证了SAODA的连接。

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2.2  绿原酸定量分析方法的建立

2.2.1  溶液的配制

1空白脂质体破乳液:精密吸取空白脂质体混悬液0.2 mL,加50%甲醇超声溶解定容至5.0 mL,过0.22 μm微孔滤膜,即得空白脂质体破乳液。

2绿原酸对照品溶液:取绿原酸对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加50%甲醇超声溶解定容至25 mL,制成绿原酸对照品溶液,过0.22 μm微孔滤膜,即得绿原酸对照品溶液。

3CA-SAL破乳液:精密吸取CA-SAL0.2 mL,加50%甲醇超声溶解定容至5.0 mL,过0.22 μm微孔滤膜,即得CA-SAL破乳液。

2.2.2  色谱条件  色谱柱为Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm5 μm);流动相为0.4%磷酸水溶液-乙腈(8218);体积流量1.0 mL/min检测波长327 nm;进样量10 μL;柱温25 ℃。

2.2.3  专属性考察  取空白脂质体破乳液、绿原酸对照品溶液、CA-SAL破乳液各进样10 μL,分别记录高效液相色谱图,在此条件下,绿原酸色谱峰峰形良好,辅料对药物的测定无干扰,见图3

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2.2.4  线性关系考察  取绿原酸对照品溶液,分别稀释制成质量浓度为60.48120.96181.44241.92302.40 μg/mL的系列对照品溶液,按“2.2.2”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以绿原酸质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得线性回归方程Y27.327 X665.82r0.999 8,结果表明绿原酸在60.48302.40 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2.5  精密度试验  取绿原酸对照品溶液重复进样测定6次,记录峰面积,计算得其RSD0.45%,表明仪器精密度良好。

2.2.6  稳定性试验  CA-SAL破乳液,分别于放置02481624 h时进样测定,结果CA-SAL破乳液绿原酸峰面积RSD1.22%,表明CA-SAL破乳液24 h内稳定性良好。

2.2.7  重复性试验  取同一批CA-SAL 0.2 mL,平行6份,置于5 mL量瓶,用50%甲醇定容,摇匀,按“2.2.2”项下色谱条件进样测定。结果绿原酸平均质量浓度为1.60 mg/mLRSD2.2%,表明该方法重复性好。

2.2.8  加样回收率试验  取“2.2.1”项下空白脂质体6份,每份0.2 mL,每份分别加入绿原酸对照品溶液(2.03 mg/mL0.2 mL,涡旋混匀,50%甲醇溶解定容至5 mL,涡旋混匀,过0.22 µm微孔滤膜,取续滤液,按照“2.2.2”项下色谱条件进行测定,结果平均回收率为99.30%RSD2.71%

2.3  脂质体包封率的测定方法

选用葡聚糖凝胶柱法进行脂质体与游离药物的分离[17-18]。取葡聚糖G-50凝胶用超纯水浸泡充分溶胀后填充于具有2层滤纸片的2.5 mL注射器内,待水分自然流下,514×g离心3 min除去多余水分,即得柱高约3.5 cm的微柱待用。

精密量取2CA-SAL 0.2 mL,其中1份加于微型凝胶柱的顶端,514×g离心3 min,继续加入0.2 mL超纯水于微型凝胶柱的顶端,514×g离心3 min,分别连续操作3次,合并收集离心洗脱液于5 mL量瓶,用50%甲醇超声溶解定容,过0.22 μm微孔滤膜。按“2.2.2”项下色谱条件进行检测,测定上柱后的峰面积,计算绿原酸质量浓度(C离心后)。另1份加于5 mL量瓶中,用50%甲醇超声溶解定容,按“2.2.2”项下色谱条件测定上柱前的峰面积,计算绿原酸质量浓度(C离心前),计算包封率,公式为包封率=C离心后/C离心前

2.4  脂质体制备方法选择

2.4.1  薄膜分散法  按课题组前期预实验比例称取脂质体膜材,即HSPC胆固醇、SA-ODA质量比为73225溶于三氯甲烷中,50 ℃减压蒸发除去有机溶剂,形成均匀脂质膜,加入3 mL相同温度质量浓度为1.67mg/mL绿原酸溶液,50 ℃水合20 min0.800.450.22 µm微孔滤膜,即得CA-SAL

2.4.2  改良逆相乙醇注入法  按课题组前期预实验比例称取脂质体膜材,即HSPC、胆固醇、SA-ODA质量比为73225,加入制剂终体积10%的无水乙醇并于50 ℃水浴中搅拌速度为320 r/min搅拌溶解。待膜材完全溶解后,继续搅拌,挥去大部分无水乙醇。将预热至相同温度的质量浓度为1.67 mg/mL绿原酸溶液注入膜材中,50 ℃水浴搅拌20 min,得到CA-SAL初品。将初品超声分散处理6 min(功率400 W,工作1 s间歇1 s)后,依次通过0.800.450.22 µm的微孔滤膜,即得CA-SAL

2.4.3 筛选结果  由于薄膜分散法制备的脂质体粒径大、包封率低(表1),因此选择改良逆相乙醇注入法。

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2.5  单因素实验

2.5.1  磷脂与药物比例考察  固定处方中的药量为5 mg,设定磷脂与药物的比例分别为51101151201251,按“2.4.2”项下改良逆相乙醇注入法制备脂质体,结果包封率分别为(28.9±1.4%、(35.9±1.2%、(47.8±2.1%、(45.2±3.6%、(46.3±3.4%,由以上结果可知,包封率随着磷脂与药物比例的增大而增大,但是当磷脂与药物比例达到151时,包封率不再提升,出于成本考虑选择磷脂与药物比例151进行载药。

2.5.2  水化温度考察  设定水化温度分别为2535455565 ℃,其他条件不变,按“2.4.2”项下方法制备脂质体,结果包封率分别为(20.9±2.3%、(30.3±1.4%、(40.6±1.1%、(46.3±2.6%、(44.6±2.4%,由以上结果可知,包封率随着水化温度的升高而增大,但是当水化温度达到55 ℃时,包封率不再升高,反而有所下降。因为当温度升高到相变温度以上磷脂流动性增强,有利于药物包封,而温度过高流动性太强导致药物漏出,对绿原酸的稳定性也会造成影响。在达到相变温度的情况下考虑选择55 ℃为水化温度。

2.5.3  水化时间考察  设定水化时间分别为2030405060 min,其他条件不变,按“2.4.2”项下方法制备脂质体,结果包封率分别为(45.3±1.3%、(46.7±1.2%、(46.6±2.4%、(40.5±2.3%、(39.6±1.6%,由以上结果可知,包封率在水化时间到达50 min后有所下降,可能是因为当包封的药物达到饱和,水化时间过长会导致药物泄漏。在药物包封完全的情况下考虑选择30 min为水化时间。

2.5.4  超声功率考察  设定超声功率分别为100200300400500 W,其他条件不变,按“2.4.2”项下方法制备脂质体,结果包封率分别为(40.5±3.1%、(43.7±2.2%、(45.4±2.4%、(44.5±1.3%、(38.6±1.4%,由以上结果可知,包封率随着超声功率间的增加而增大,但是当超声功率到了300 W时,包封率不再升高,反而下降,可能是因为超声功率过高导致部分药物泄漏。在考虑超声分散均匀的情况下选择超声功率为300 W

2.5.5  超声时间考察  设定超声时间分别为246810 min,其他条件不变,按“2.4.2”项下方法制备脂质体,结果包封率分别为(42.6±1.1%、(45.8±3.2%、(45.4±2.1%、(39.5±2.3%、(35.6±1.7%,由以上结果可知,包封率开始随着超声时间的增加而变化不大,但是当超声时间到了8 min时,包封率开始出现了明显的下降,可能是因为超声时间过长导致部分药物泄漏。考虑选择超声时间为6 min

2.5.6  磷脂种类考察  分别采用HSPCSPCEPCDSPC 4种不同的磷脂,其他条件不变,按“2.4.2”项下方法制备脂质体,结果包封率分别为(46.4±3.1%、(38.8±2.5%、(39.4±1.5%、(44.4±2.8%,结果表明HSPCDSPC的效果较好。在考虑到HSPC较为经济的情况下选择磷脂种类为HSPC

2.6  Box-Behnken响应面法优化脂质体制备工艺及处方

2.6.1  响应面实验设计及结果  应用Design Expert 12.0软件进行响应面设计,在前期单因素试验的基础上,以CA-SAL包封率(Y1)和载药量(Y2)为响应值,影响较为显著的磷脂与药物质量比(X1)、水化温度(X2)、超声功率(X33个因素为考察对象,采取3因素3水平Box-Behnken响应面优化法,确定最佳制备工艺。考察因素水平、试验设计及结果见表2

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2.6.2  模型的建立及其显著性检验  通过Design- Expert 12.0软件对表2数据进行拟合,得到方程为Y1157.235.06 X13.94 X20.12 X30.069  X1X28.70×10−3X1X31.53×10−3X2X32.50×10−3 X120.037 X223.51×10−4 X32Y213.359370.930 5 X10.192 25 X27.725×10−3X33×10−3X1X25×10−5X1X31×10−4X2X30.024 9 X121.975×10−3X223.225×10−5X32。方差分析表见表3。模型P0.05,具有显著性影响,而失拟项P0.05,表明失拟不显著。模型的相关系数(r2)分别为0.984 50.991 8,调整确定系数(radj2)分别为0.964 60.981 2,该模型与实际试验拟合程度良好,用该模型分析和预测脂质体制备是合适的。

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2.6.3  响应面分析  通过Design-Expert 12.0软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析,绘制响应面曲线图,响应曲面陡峭程度越大,则对包封率和载药量的影响也越大。结果见图45

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2.6.4  最佳工艺的确定和验证  期望脂质体包封率和载药量处于最大值为优化指标,通过Design- Expert 12.0软件分析,最终确定CA-SAL制备的最佳工艺条件为磷脂与药物质量比为151,水化温度为60 ℃,超声功率为400 W。在该条件下CA- SAL的理论包封率为60.5%,说明利用Box-Behnken建立的模型是合理的。对结果进行验证,重复3次,CA-SAL的平均包封率为57.8%RSD0.1%,载药量为2.3%RSD0.5%,说明该模型得到的结果可靠。

按照上述CA-SAL最佳制备工艺制备绿原酸脂质体(CA-CL),膜材中不加入SA-ODA

2.7  脂质体理化性质的初步研究

2.7.1  脂质体形态的观察  本实验制备得到的脂质体均外观澄清透明,呈淡蓝色乳光,结果见图6。将脂质体混悬液滴入铜网,然后用2%磷钨酸染色制备样品。然后对样品进行干燥,置于透射电镜下观察。如图7示,CA-CLCA-SAL均呈类球型,圆整。

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2.7.2  粒度及Zeta电位考察  将取适量制备的脂质体稀释一定倍数后,于激光粒度分析仪测定粒径、Zeta电位及多分散系数(PDI)。测得CA-SAL的数据。CA-SAL平均粒径为(90.13±0.51nmPDI0.16±0.01Zeta电位为(−25.3±0.5mV

2.7.3  放置稳定性  取制备的脂质体3批,于4 ℃条件下放置保存,分别于第01个月取样,观察是否有分层、沉淀现象,考察粒径及包封率变化情况。结果见表4CA-SAL4 ℃条件下存放1个月,有少量沉淀和絮凝产生,经振摇可复原,均匀性良好,包封率和粒径均无显著性变化。结果表明,CA-SAL4 ℃条件下稳定性较好。

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2.8  体外释放

分别取1 mL CA-CLCA-SAL、绿原酸溶液(均含绿原酸4mg)置入透析袋中加入释放介质(PBSpH 6.825 mL,于37 ℃、100 r/min恒温振荡。分别于0.5124612 h取样1 mL(同时补充等温等量释放介质),用HPLC法测定绿原酸质量浓度,计算3组样品各时间点累积释药分数并作图。结果如图8所示,绿原酸溶液在最初0.5 h释放已达到71.2%4 h时绿原酸溶液的累积释放率为99.8%,已经基本释药完全。而CA-CLCA-SAL无明显突释现象,在0.5 h的累积释放率分别为15.6%17.8%12 h时,CA-CLCA-SAL的累积释放率分别为60.1%58.4%。综上所述,CA-CLCA-SAL与游离药物相比,具有一定的缓释作用,且二者的释放曲线相似,说明SA的修饰对药物释放无明显影响。

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2.9  CA-SAL的细胞毒性实验

培养A549细胞并接种于96孔板中,当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时,以含10% FBS的培养基为空白对照组,以未经药物处理过的细胞悬液为阴性对照组,加入3个质量浓度(300600900 μg/mL)的游离绿原酸、CA-CLCA-SAL。继续培养48 h后,采用MTT法检测各组490 nm处吸光度(A)值,计算细胞存活率,结果见图9。在低质量浓度时CA-CLCA-SALA549细胞没有出现抑制,CA-CLCA-SAL随着药物质量浓度的增加对A549细胞的增殖抑制率增强。在相同给药浓度下,CA-SALA549细胞的增殖抑制作用显著强于CA-CL

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2.10  细胞摄取实验

2.10.1  香豆素-6储备液制备  精密称取香豆素-6适量于5 mL量瓶中,无水乙醇溶解定容至刻度,制成0.6 mg/mL的香豆素-6溶液,过0.22 μm微孔滤膜,即得。

2.10.2  载香豆素-6脂质体(C6-CL)制备  取脂质体膜材HSPC-胆固醇103),加入0.5 mL香豆  -6储备液,60 ℃水浴中搅拌溶解。待膜材完全溶解后,继续搅拌,挥除大部分溶剂。将预热至相同温度超纯水注入膜材中,60 ℃水浴搅拌20 min,得到C6-CL初品。将初品超声分散处理6 min(功率400 W,工作1 s间歇1 s)后,依次通过0.800.450.22 µm的微孔滤膜,即得C6-CL

2.10.3  载香豆素-6唾液酸修饰脂质体(C6-SAL)制备  按质量比73225称取HSPC胆固醇、SA-ODA,加入0.5 mL香豆素-6储备液,60 ℃水浴中搅拌溶解。待膜材完全溶解后,继续搅拌挥除大部分溶剂。将预热至相同温度的超纯水注入膜材中,60 ℃水浴搅拌20 min,得到C6-SAL初品。将初品超声分散处理6 min(功率400 W,工作1 s间歇1 s)后,依次通过0.800.450.22 µm的微孔滤膜,即得C6-SAL

C6-CLC6-SAL的粒径和PDI测定结果见表5

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2.10.4  细胞摄取  A549细胞按照1×105/孔接种于24孔板中,培养24 h后弃去培养基,替换为分别含C6-CLC6-SALSAC6-SAL的培养基,于CO2培养箱中分别孵育4 h,弃去培养基,加入适量PBS清洗3次,加入2 μg/mL DAPI溶液,室温孵育20 min,加冰PBS漂洗3次,加4%多聚甲醛固定15 min,弃去多聚甲醛,用冰PBS保存。倒置荧光显微镜观察细胞摄取情况。A549细胞对各组脂质体的摄取情况见图10。可以观察到A549细胞在C6-SALSAC6-SAL组的荧光亮度明显高于C6-CL组,SAC6-SAL组的荧光亮度较C6-SAL组有所下降,是由于游离SA的竞争受体减少了A549细胞对C6-SAL的摄取。

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3  讨论

本实验采用改良逆相乙醇注入法制备绿原酸脂质体,与薄膜分散法所制备的绿原酸脂质体[19-20]相比其粒径更小分散的更为均匀。

影响CA-SAL制备的因素有很多,如磷脂种类、药脂比、水化时间、超声时间及功率等,为了考察各因素综合影响,需要进行多因素多水平试验。Box- Behnken是近年来常用的响应面设计方法[21-22],响应面设计可以将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的1次或2次多项式模型来拟合,计算比较简便,与正交试验相比,可以在试验条件寻优过程中连续的对试验的各个水平进行分析[23-24],得到最优的条件。包封率和载药量是评价脂质体质量的重要指标[25-26],绿原酸作为水溶性小分子药物,本身包封率较低[27],通过响应面优化制备工艺后,提高了脂质体的包封率。

研究表明绿原酸具有良好的抗肿瘤活性[28]。本研究将绿原酸制备成脂质体来提高绿原酸的稳定性,并考察其抗肿瘤活性。细胞毒性实验显示,绿原酸脂质体对A549细胞增殖具有一定的抑制作用,唾液酸修饰后的绿原酸脂质体相比于普通脂质体对A549细胞的抑制作用明显增强。为考察肿瘤细胞对唾液酸修饰绿原酸脂质体的摄取能力,以香豆素-6为荧光标记来显示唾液酸修饰前后的脂质体的体外摄取。细胞摄取实验结果显示,C6-SAL组的荧光强度明显强于C6-CL组,其与细胞毒性实验结果一致。而通过竞争抑制实验,验证了C6-SAL摄取的增加是由于唾液酸的修饰,从结果可知与C6-SAL相比,C6-SALSA组的细胞摄取显著减少,这可能是因为唾液酸的预先过饱和孵育结合了A549细胞上的唾液酸受体,导致SA修饰脂质体无法利用表面修饰的唾液酸与细胞表面的受体进行配体-受体介导的特异性反应增加其细胞摄取。

综上所述,本研究通过响应面优化制备了粒径小、稳定性好的唾液酸修饰的绿原酸脂质体,并具有一定的体外抗肿瘤活性。在后期实验研究中将进一步考察其体内的药效学以及体内靶向能力。

参考文献(略) 

来  源:朱顺耀,来银芳,李晓稳,李晶晶,石森林,张  婷.唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究 [J]. 中草药, 2020, 51(24):6178-6188.

唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究

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