沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响

沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响

沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响

 要:目的 研究3种沉淀抑制剂(PPI)羟丙基甲基纤维素K4MHydroxypropyl methyl cellulose K4MHPMC K4M)、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯MGHypromellose Acetate Succinate MGHPMC AS MG)、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(PolyvinylpyrrolidoneSoluplus)对临床口服剂量下pH值诱导延胡索乙素(dl-THP)过饱和相行为的影响。方法 绘制dl-THPpH-溶解度相图和pH值转换过程中的去过饱和曲线,用溶解度相图佐证dl-THP相行为,以质量浓度-时间曲线下面积和过饱和度为指标分析沉淀抑制剂对dl-THP相行为的影响;采用偏振光显微镜、差示扫描量热法分析沉淀性质。结果  临床给药剂量下,dl-THPpH值转换过程中最大过饱和度为3.93,随时间推移失去过饱和;HPMC K4MHPMC AS MGSolupluspH值转换180 min内均能维持过饱和度。HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus在浓度5%时维持过饱和度分别为1.191.891.36,浓度20%时为1.302.351.86、浓度50%时为1.302.602.07。偏振光显微镜和差示扫描量热法结果表明产生结晶沉淀。结论  沉淀抑制剂均能改善pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为,且这种改善行为随沉淀抑制剂种类和浓度的不同而不同,HPMC AS MG作用效果最佳。

水溶性差是口服给药中的一个普遍问题,溶解度低可能使药物吸收少而使血药浓度达不到治疗水平[1]。由于药物吸收在一定浓度范围内随着药物溶液浓度的增加而线性增加,过饱和溶液可通过提高药物浓度而增加被动吸收[2-3],故过饱和给药系统近年来被广泛用于提高溶解度和生物利用度[4]。然而过饱和溶液不稳定,易发生结晶等相行为变化而降低过饱和给药系统的优势,沉淀抑制剂被广泛用于延缓过饱和药物递送系统的去过饱和速率[5-7]而改变过饱和溶液的相行为。因此研究沉淀抑制剂对药物在过饱和溶液中相行为的影响对过饱和给药系统处方的研究有良好的实践意义。
弱碱性药物是一类重要的药物化合物,其特征是在胃的酸性pH值下,具有较高的溶解度,而在转移到肠液时,弱碱性药物的溶解度下降而在小肠中到达过饱和[8]。弱碱性药物肠道的过饱和具有较高的能量有利于吸收,但不稳定,易在小肠产生结晶,从而影响弱碱性药物的口服生物利用度[4],故需要绘制pH值溶解度相图确定相行为
延胡索乙素(dl-THP)镇痛效应强,可缓解头痛、胸痛、关节痛及外伤导致的疼痛[9-10],对慢性神经病理性疼痛效果较好[11]dl-THP为生物碱类化合物,其碱性基团的pKa值为6.49,生物利用度仅为29.7%[12]。为了解其在胃肠转运过程中的相行为是否可能是影响其生物利用度的一个原因,因此本实验先研究pH诱导临床给药剂量下延胡索乙素的过饱和的相行为,随后研究3种沉淀抑制剂对pH诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响,为延胡索乙素改良制剂的研究提供基础信息

1 仪器和材料

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;雷磁PHS-2F-pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;ZRS-8G型智能溶出仪,天津天大天发科技有限公司;Spectrum TwoFT-IR红外光谱仪、Diamond DSC型差示扫描量热分析仪,美国PerkinElmer公司;明美Mshot MS60偏振光显微镜,广州市明美光电技术有限公司; PLUS-E2-10TH衡量分析型超纯水机,南京易普易达科技发展有限公司。

1.2 材料

dl-THP,质量分数>98%,批号YHS20191209,西安昊轩生物科技有限公司;dl-THP对照品,批号110726-200610,质量分数>98%,中国食品药品检定研究院;牛黄胆酸钠(批号610L052)、鸡蛋卵磷脂(批号701L021)、马来酸(批号720L023),北京索莱宝科技有限公司;羟丙基甲基纤维素(HPMC K4M),批号20180307,西安天正药用辅料有限公司;醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯(HPMC-AS MG),亚什兰集团,批号60G-610002;聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus),巴斯夫中国有限公司,批号66458088Q0;其余试剂均为分析纯;用水均为超纯水。

2  方法与结果

2.1  dl-THP含量测定方法

2.1.1 色谱条件  色谱柱为ODS柱(160 mm×25 mm5 μm);流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(三乙胺调pH6.0)(7030);体积流量1 mL/min;检测波长280 nm;进样量10 μL;柱温37 [13-14]

2.1.2  对照品溶液配制  精密称取dl-THP对照品5.20 mg10 mL量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,配制520 µg/mL的对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液配制  取待测溶液适量,0.22 µm滤头滤过,加60%甲醇稀释适当倍数,得到供试品溶液。

2.1.4 线性范围考察  分别取0.20.40.60.81.01.6 mL对照品储备液,60%甲醇稀释定容至10 mL,摇匀,得质量浓度为10.420.831.241.652.083.2 µg/mL对照品溶液。进样测定,以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得到回归方程为Y10.423 X14.849R20.999 1,结果表明dl-THP10.483.2 µg/mL峰面积与质量浓度线性关系良好。

2.1.5 精密度试验  取“2.1.2”项下方法配制的52.0 μg/mL dl-THP对照品溶液,连续进样6次,记录HPLC图谱中dl-THP的峰面积,计算其RSD0.26%,说明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验  取同一待测溶液6份,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,进样测定峰面积,计算dl-THP质量分数的RSD0.96%,说明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验  精密量取适量已测定dl- THP质量浓度的待测溶液,平行操作6份,按所含dl-THP质量比11加入52.0 μg/mLdl-THP对照品溶液适量,制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样10 μL,记录峰面积,计算平均加样回收率为99.74%RSD0.63%

2.2 溶液配制

2.2.1  人工胃液[15取牛黄胆酸钠43.01 mg、鸡蛋卵磷脂15.16 mg、氯化钠1.368 0 g,置于至于烧杯中加水适量,超声溶解,转移至1 000 mL量瓶中,定容,摇匀。盐酸调pH值为1.60[16]

2.2.2 不同pH值缓冲液的配制  Na2HPO4·12 H2O 35.82 gKH2PO4 13.61g,置于1 000 mL量瓶中,溶解,定容,摇匀,加H3PO44 mol/L NaOH溶液调pH值至各值pH值。

2.3 延胡索乙素pH-溶解度相图的绘制

2.3.1  晶体平衡溶解度测定(Se  分别在不同pH值缓冲液(1.606.006.507.007.508.00)中加入过量的dl-THP,涡旋5 min后,超声20 min助溶,37 ℃恒温摇床放置24 h,直至平衡,0.22 µm滤膜滤过,续滤液用60%甲醇稀释适宜倍数后,采用HPLC法测定峰面积,计算质量浓度及平衡溶解度(图1);同时,以pH 8时测定的溶解度为未解离时的总溶解度(CU),根据Henderson-Hasselbalch方程CT(1X)CU/XX10(pHpKa)计算不同pH值时晶体平衡溶解度(CT,包括解离和未解离的药物质量浓度)。结果显示dl-THP晶体溶解度随pH值增大,溶解度明显降低,实测值与计算值无明显差别。

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2.3.2  非晶溶解度测定(amorphous solubilitySa

参照Indulkar[17]的方法,将50 mg/mL dl-THP的二甲基亚砜(DMSO)溶液以10 µL/min体积流量加入至30 mL50 µg/mL HPMC AS MG的不同pH值(6.006.507.007.508.00)磷酸缓冲液中,使DMSO的最终浓度少于2%100 r/min磁力搅拌,每隔30 s取样,样品加入紫外比色皿中,测定450 nm(通过全波长扫描选择药物、HPMC AS MG和溶剂均无吸收的波长作为非吸收波长)处的吸光度。记录吸光度数据,通过溶液体积、加入体积流量和时间计算dl-THP质量浓度,将质量浓度和吸光度数据导入Origin软件,进行曲线分段拟合,2条拟合直线交点-吸光度发生突变的点,即为非晶溶解度(图1)。

Indulkar[17]研究表明非晶溶解度随pH值的变化也遵守Henderson-Hasselbalch方程,故也同时通过Henderson-Hasselbalch方程,按“2.3.1”项下方法计算各pH值下的非晶溶解度,结果显示,非晶溶解度与结晶溶解度随pH值的变化具有相同的趋势,均随pH值增大而降低,计算值与实测值无明显差异

2.3.3  pH-溶解度相图绘制  dl-THP在胃液pH值条件下溶解度大,排空至肠液后dl-THP所处的环境pH值增大,可能产生沉淀降低游离药物质量浓度而影响吸收,故选择可能出现沉淀的肠道pH值(6.006.507.007.508.00)下测定晶体溶解度和非晶溶解度,阐明dl-THP可能发生的相变。将不同pH值下的晶体和非晶溶解度数据导入Graphpad Prism软件,得到dl-THPpH-溶解度相图(图1)。pH-溶解度相图分成3个区域[3]:药物质量浓度低于该条件下的结晶平衡溶解度的亚饱和区,该区域内无沉淀;药物质量浓度介于结晶溶解度与非晶结晶溶解度之间的结晶过饱和区,该区域将发生结晶相变;药物质量浓度大于非晶溶解度的不稳定区。

2.3.4  不同pH值时的最大过饱和度(Sm  非晶溶解度为最大可达过饱和药物质量浓度,故非晶溶解度与晶体溶解度的比值为该条件下的Sm,不同pH值时的Sm如图2所示,pH值为6.50时存在的Sm最大,为9.03

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2.4  pH转换相行为研究

按文献方法以dl-THP临床口服给药量(120 mg)进行pH值转移相行为研究[18]。将60 mg dl-THP分散在125 mL 37 ℃预热的pH1.60的人工胃液中,人工胃液中分别含有05%24 µg/mL)、20%96 µg/mL)、50%240 µg/mL)的HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus。转速100 r/min,分散20 min,于25101520 min分别取液1 mL并迅速补液,0.22 µm滤头滤过,滤液60%甲醇稀释10倍,按“2.1”项下方法测定峰面积,计算质量浓度。取分散后的溶液30 mL转移至60 mL pH值为6.50缓冲液中,并用200 µL 4 mol/L NaOH溶液调节转移后的pH值为6.50。转移后于5101530456090120150180 min各时间点取液1 mL迅速并补液,0.22 µm滤头滤过,滤液60%甲醇稀释3倍,按“2.1”项下HPLC方法测定其质量浓度。将数据导入Graphpad Prism软件,得到时间-质量浓度曲线(3-a5-a)、时间-过饱和度(S)曲线(实测质量浓度/晶体平衡溶解度;3-b5-b)、质量浓度-时间曲线下的面积(AUC20200 min3-c5-c

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dl-THPpH1.60的人工胃液中,20 mindl-THP质量浓度为(478.79±10.58µg/mL,转移至pH 6.50的磷酸缓冲液后dl-THP质量浓度逐渐下降,过饱和度由3.93下降至1左右,同时出现沉淀。3PPI对其在pH 1.60条件下中溶出无明显影响。转移至pH6.50磷酸缓冲液后,3PPI均能够维持dl-THP pH值诱导后的过饱和,但作用效果各不相同。浓度为5%24 µg/mL)时,HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus作用下AUC20200 min分别为未加PPI110.66%174.60%133.91%,过饱和度分别由3.93下降至1.191.891.36,浓度为20%96 µg/mL)时,HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus作用下AUC20200 min分别为未加PPI135.33%189.88%133.91%,过饱和度分别由3.93降至1.302.351.86。浓度为50%240 µg/mL)时,HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus作用下AUC20200 min分别为未加PPI141.13%199.28%178.39%,过饱和度分别由3.93降至1.302.602.07。在不同质量浓度下作用效果均为HPMC AS MGSoluplusHPMC K4M。分散比较各时间点的过饱和度,浓度为5%20%50%时,加与未加PPI过饱和度存在显著差异的初始时间分别为805035 min,且随时间的推移各时间点过饱和度均为HPMC AS MGSoluplusHPMC K4M。由此可知随着质量浓度的增加,PPI产生作用效果的时间提前。综上所述,HPMC AS MG维持pH值诱导dl-THP的过饱和相行为结果最佳。

2.5 沉淀分析

2.5.1  偏光显微镜(polarized light microscopyPLM)分析  取“2.4”项下pH值转换180 min磷酸盐缓冲液液体20 µL,置于洁净的载玻片上,盖上盖玻片,置于偏光显微镜下、3 min内完成观察。偏光显微结果(图6)显示dl-THPpH值转换后产生的沉淀具有明显双折射现象,表明产生结晶沉淀。加入3PPI后,沉淀量随PPI加入量的增加而减少;在同一质量浓度下,加入3PPI的结晶沉淀量按HPMC AS MGSoluplusHPMC K4M顺序增加,与药物质量浓度—时间曲线结果一致。

沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响

2.5.2  固体沉淀的制备  为保证实验的统一性及沉淀量尽可能的大,故取“2.4项下”pH值转换180 min的磷酸盐缓冲液液体,15 000 r/min21 380×g)离心5 min,收集沉淀,沉淀真空干燥24 h,放入干燥器内密封保存。

2.5.3  差示扫描量热法(differential scanning calorimeterDSC  取少量待测沉淀置入铝皿中后放入DSC样品炉中,25 ℃恒温1 min10 /min速率升温至170 ℃。得到谱图(图7)。由图7可知HPMC K4MHPMC AS MGSoluplus 3种辅料均未见吸热峰。dl-THP,未加PPINO PPI)、加HPMC K4MPPI/HPMC K4M)、HPMC AS MGHPMC AS MG/PPI)、SoluplusPPI/Soluplus)的样品分别在140.72140.67138.50140.32140.32 ℃出现尖锐的吸收峰,表明存在结晶型沉淀,峰位发生的偏移可能是加热后dl-THP溶解在PPI中,使得熔点峰发生了偏移[19]

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3  讨论

dl-THP为生物碱类化合物,其溶解度受pH值的影响。口服dl-THP后,dl-THP经历pH值逐渐增大,溶解度逐渐减小。故本研究测定pH1.60的平衡溶解度作为胃内环境的溶解度,阐明dl-THP在胃环境能够完全溶解,同时测定pH6.006.507.007.508.00的平衡溶解度作为不同pH值肠液环境下的溶解度,阐明肠道pH值下dl-THP可能发生的过饱和沉淀行为。

药物质量浓度与药物的吸收速度密切相关,体外传质研究表明,穿过人工膜的通量随着溶液浓度的增加而线性增加,直到在无定形溶解度处达到最大值[1]。本实验通过实验测定和计算晶体溶解度及非晶溶解度2种模式相互佐证确保2种溶解度结果准确,并绘制pH-溶解度相图,根据相图,可以确定dl-THP的最大可达过饱和程度,即浓度对吸收影响的最大可达程度,从而明确未达最大过饱和程度过饱和溶液的最大可改善空间。

药物溶液相图理论指出药物的浓度处于不稳定区时药物会快速沉淀,慢结晶药物形成无定形沉淀,快结晶药物形成结晶型沉淀;药物浓度处于亚稳定区时,在一定的条件下仅可产生结晶性沉淀[20]。在250 mL给药体积下,临床给药剂量完全溶解时所能达到的溶解度远少于dl-THPpH1.60时溶解度(11.15 mg/mL),故pH值转换实验观察到20 mindl-THP完全溶解(478.80 µg/mL)。转换到pH6.50的磷酸缓冲液中时,计算质量浓度约为160.00 µg/mL,界于无定形溶解度(367.54 µg/mL)和晶体溶解度(40.70 µg/mL)之间,即处于亚稳定区,在该处仅能产生结晶沉淀,偏振光显微镜和差示扫描量热分析均显示dl-THP为结晶沉淀,说明dl-THP在溶剂转换中的相行为能够用pH值相图解释

dl-THPpH值转换实验中显示会快速产生结晶沉淀,导致游离药物质量浓度较低,这可能是dl-THP生物利用低的原因,由于药物的被动吸收与其过饱和度大小及维持时间有关[18],因此采用PPI抑制结晶以较长时间地将药物浓度维持在更高的过饱和度对dl-THP生物利用度改良制剂的开发是有意义的。本实验研究HPMC K4MHPMC AS MGSolupluspH值诱导dl-THP过饱和的影响。3PPI均能够维持pH诱导dl-THP的过饱和,pH值转换研究结果表明,与未加PPI比较,加入5%20%50% HPMC K4MHPMC AS MGSoluplusAUC20200 min分别增加了10.66%35.33%41.13%74.60%89.88%99.28%33.91%63.22%78.39%。不同质量浓度下HPMC AS MG维持过饱和度效果均优于HPMC K4MSoluplus。这种变化趋势与偏振光显微分析结果一致,显示3PPI对相行为的改善随抑制剂种类不同而不同,并与PPI浓度呈正相关,与Etherson[21]研究结论一致。结果同时显示HPMC AS MG作用效果最佳

目前已有文献报道的dl-THP制剂学研究主要基于dl-THP为脂溶性药物,从而通过增加溶解度的方法将dl-THP制成纳米制剂[22]、环糊精包合物[23]、微球[24]、醇质体[25]等以提高其溶出度或生物利用度。本研究重在考虑dl-THP的碱性,结合胃肠道pH值环境阐明口服dl-THP可能出现的相变行为,并研究3PPI对其相行为的影响未有文献报道。本研究优选出对pH值诱导dl-THP相变改善作用最强的PPIHPMC AS MG),可为dl-THP制剂开发提供基础

参考文献(略) 

来  源:丁海波,蒋且英,陈绪龙,欧阳料淇,刘  欢,曾慧玲,廖正根.沉淀抑制剂HPMC K4M、HPMC AS MG、Soluplus对pH值诱导延胡索乙素过饱和相行为的影响 [J]. 中草药, 2020, 51(24):6189-6195.

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