Cell | WLS/Evi介导Wnt转运和分泌的结构基础

撰文 | 章台柳
Wnts是一个分泌性脂质修饰的糖蛋白家族,参与调控形态发生、细胞干性和细胞命运决定。细胞分泌Wnt,通过局部作用达到附近的受体细胞,与多种细胞表面受体相互作用,包括人Frizzleds家族、Wnt共受体如LRP5/6和受体酪氨酸激酶ROR2。Wnt-受体互作可诱导不同的下游信号反应,包括稳定β-catenin、调控基因表达、激活JNK和调控细胞极性等。
Wnt中一个极为重要的生物学特征是单不饱和棕榈油酸酯(PAM)与丝氨酸残基共价连接,而该丝氨酸残基基本上在所有Wnt中保守。这种O-酰化修饰使Wnt蛋白具有高度的疏水性,需依赖载体进行细胞内和细胞间运动。Wnt棕榈酸酰化修饰是在内质网上被膜结合的O-乙酰基转移酶(PORCN)所催化。酰化后,Wnt能够与内质网上保守的膜转运蛋白(称为WLS、Evi和GPR177)结合【1】,用于跨细胞内转运和分泌。WLS是整合型的膜蛋白,预测有8个跨膜螺旋,有一个延展的管腔环(这是Wnt结合所必需的),胞质C端有一个ER再循环序列。WLS预测与G蛋白偶联受体同源,又被称作GPR177。PORCN催化的乙酰化对于Wnts与WLS结合是必需的【2】,突变Wnt的棕榈酸酰化位点、抑制PORCN和下调WLS表达都能抑制Wnt从ER的离开和分泌,从而影响Wnts的功能。从内质网到细胞质膜,Wnt-WLS复合物可能将Wnt转移到细胞表面蛋白聚糖、可溶性转运蛋白、细胞质或外泌体中。最终,Wnts被递送到Frizzled(FZD)并激活下游信号,该过程依赖于O-PAM修饰。WLS可从质膜再循环回内质网,进行下一轮Wnt转运循环。那么,一个新的棕榈酸酰化的Wnt如何被PORCN转送给WLS?Wnt、O-PAM和WLS如何组装成转运高效的复合物?Wnt如何从WLS转移到各种转运体和邻近细胞的FZD?这些问题都还有待进一步的研究。
近日,来自杜克大学医学院的David M. Virshup和哥伦比亚大学欧文医学中心的Filippo ManciaCell杂志上发表文章Structural Basis of WLS/Evi-Mediated Wnt Transport and Secretion,解析了棕榈酸酰化的WNT8A-WLS的3.2Å冷冻电镜结构。分析发现,WLS膜结构域与GPCRs有类似的结构同源性。Wnt发夹(hairpin)结构插入WLS膜结构域的保守疏水腔中,两个螺旋之间的棕榈酸酰化修饰深入到磷脂双层。而另一个Wnt发夹上高度保守残基的构象转换有助于其转移到邻近细胞的受体上。
Cell | WLS/Evi介导Wnt转运和分泌的结构基础
研究人员选择人源WNT8A和人源WLS进行探索,首先验证棕榈酸酰化依赖的WNT8A-WLS复合物的形成对于Wnt转运到细胞表面是必需的。随后解析了分辨率为3.2Å的冷冻电镜结构,并构建了一个模型,该模型包含WLS(共541个氨基酸)的氨基酸残基4-496,以及WNT8A(共351个氨基酸)的氨基酸残基30-337。模型缺乏WLS C端尾部(残基497-541)和WNT8A的3个环(115-125、223-240和279-287),这些部分较为无序。WNT8A-WLS复合物结构显示WLS具有两个独特的组分:一个是8个跨膜(TM)螺旋组成的完整的膜结构域,N和C末端位于细胞质侧;另一个是位于TM1和TM2之间的球状管腔结构域(WLS LD),这是Wnt结合所必需的。WLS LD是由8个反向平行的β片层组成的紧凑结构,组装成一个β三明治。此外,WLS LD与参与脂滴形成的ER蛋白seipin具有结构同源性。
复合物结构显示,WNT8A的Asn103和Asn262具有N-连接的糖基化修饰。Asn262连接的聚糖非常靠近假定的LRP5/6结合位点;Asn103连接的聚糖非常靠近WLS的广泛亲水表面,或介导该区域两种蛋白质之间的相互作用,突变Asn103则降低WNT8A的产生和信号活性,提示这个位点的聚糖具有重要的功能作用。当WNT8A与WLS形成复合物时,其结构具有高度保守的核心:由五个螺旋构成,其中三个发夹环从中延伸,两个环——发夹2和3组装成β折叠股,形成β折叠。两者之间的互作界面是非常广的,包埋表面具有2403Å2,有助于两者形成紧密结合。Wnt-FZD CRD结构中,Wnt发夹1直接与发夹2相互作用;而在WNT8A-WLS结构中,发夹1和发夹2被WLS LD的第一个β折叠所分开。发夹1延伸了两个保守的色氨酸残基——Trp127和Trp129,和WLS TM1和TM2顶部高度保守的残基(Ser104、Phe107、Asn227和Gly229)进行接触。发夹2由两个二硫键稳定,顶端携带PAM与绝对保守的Ser186结合。发夹2深入WLS TM结构域,并与中心疏水腔形成多个接触,这个中心疏水腔也由保守残基构成。在WLS Gly305的帮助下,PAM依次穿过TM螺旋4和5之间的狭窄疏水通道。WNT8A Ser186的PAM酯键主要是通过WLS Asp301和WLS Arg357之间的离子相互作用进行配位。突变WNT8A发夹1、发夹2及WLS上相应结合位点均损伤Wnt信号,减少Wnt分泌。即WLS和Wnt发夹1、2之间的相互作用对于新合成的棕榈酸酰化Wnts的分泌是非常重要的。Wnt的发夹3从螺旋核心到WLS LD的上部形成一个拱形,深入到一个保守的疏水性口袋中。对比Wnt-FZD CRD和Wnt-WLS结构发现,发夹3中Phe316和Trp318的取向不同,这些残基的侧链在这两种结构之间发生明显的变化,这表明当Wnt改变结合伙伴时,发夹3或起到分子开关的作用。此外,突变WNT8A发夹3中保守的WCC基序不影响Wnt的分泌,但损伤其信号激活;而且发夹3被3个高度保守的二硫键所稳定,而这些二硫键的形成对于棕榈酸酰化和WLS互作都不是必需的,而对WNT3A与FZD CRD的结合是必需的。即Wnt发夹3对于Wnt与FZD CRD互作更重要。
对比WNT8A-WLS和xWnt8-FZD的结构,发现Wnt的α螺旋核心基本没有变化,但发夹环明显有移动。WNT8A的发夹1和发夹2被WLS LD分开,而Wnt-CRD中两个发夹紧密结合形成一个β折叠。Wnt发夹的这种灵活性可能有助于Wnt和多种蛋白结合,如WLS、FZD CRD、PORCN、ROR1等。WLS TM域中深埋着一个大洞,这个空间在顶部向管腔侧开放,通过TM螺旋6和7之间的间隙向脂类双层开放,这可能是棕榈酸酰化的Wnt发夹2进入和退出的潜在途径。进一步分析发现,WLS与G蛋白偶联受体具有结构同源性,或可作为靶点用于抑制Wnts蛋白的分泌。
Cell | WLS/Evi介导Wnt转运和分泌的结构基础
总的来说,研究解析了Wnt-WLS复合物的结构,从结构的角度揭示了Wnt分泌过程的机制,或为抑制Wnts蛋白分泌提供潜在的药物靶点。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.038
制版人:琪酱

参考文献

1.   Bartscherer, K.,Pelte, N., Ingelfinger, D., and Boutros, M. (2006). Secretion of Wnt ligandsrequires Evi, a conserved transmembrane protein. Cell 125, 523–533.
2.   Coombs, G.S.,Schmitt, A.A., Canning, C.A., Alok, A., Low, I.C., Banerjee, N., Kaur, S.,Utomo, V., Jones, C.M., Pervaiz, S., et al. (2012). Modulation of Wnt/b-catenin signaling and proliferation by a ferrous iron chelator withtherapeutic efficacy in genetically engineered mouse models of cancer. Oncogene 31, 213–225.
Cell | WLS/Evi介导Wnt转运和分泌的结构基础
生物医学科研方法

lncRNA与蛋白结合预测数据库网站

2021-1-1 7:16:19

生物医学科研方法

郑春福教授撰写NOD样受体在抗病毒天然免疫中最新研究进展的综述

2021-1-1 7:24:47