《自然·微生物》| 土壤中广泛存在大量活跃的痕量气体氧化微生物

【题    目】

Trace gas oxidizers are widespread and active members of soil microbial communities

【期    刊】

Nature Microbiology(IF2019=15.54

【全文链接】

https://doi.org/10.1038/s41564-020-00811-w

【第一作者】

Sean K. Bay
【通讯作者】
Eleonora Chiri & Chris Greening

【其他作者】

董西洋, James A. Bradley, Pok Man Leung, 

Rhys Grinter, Thanavit Jirapanjawat, Stefan K. Arndt, 

Perran L. M. Cook, Douglas E. LaRowe & Philipp A. Nauer

【作者单位】

 Monash University(澳大利亚)

中山大学

Queen Mary University of London(英国)

GFZ German Research Centre for Geosciences(德国)

University of Melbourne(澳大利亚)

University of Southern California(美国)

土壤-大气界面痕量气体循环过程及参与者

摘要

有机碳源是土壤微生物维持生存的主要能量来源。某些细菌也能以痕量气体等无机物作为能量来源,但除了在某些贫瘠土壤之外,它们以往都被认为是十分稀有的。本文结合宏基因组学、生物地球化学和热动力学建模等方法,明确了土壤微生物群落是如何满足能量来源和碳需求的。通过对40个宏基因组数据和757个衍生的基因组的分析表明,超过70%的土壤细菌类群编码消耗无机能源的酶。来自19个门的细菌可编码利用痕量氢气和一氧化碳作为有氧呼吸额外电子供体的酶。此外,我们发现了第四个具有潜在甲烷氧化能力的门(芽孢杆菌门,Gemmatimonadota。不同类型土壤中的微生物群落能很快地将氢气、一氧化碳和少量甲烷氧化至低于大气中的浓度水平,这与宏基因组分析结果是一致的。热力学模型表明,细菌氧化这三种气体所产生的能量足以满足它们对能源的需求。多种细菌还可编码使用痕量气体作为电子供体来进行碳固定的酶。总而言之,这些结果表明,在土壤生态系统中当微生物偏好的有机底物不足时,痕量气体氧化的能力赋予了这些微生物在土壤生态系统中的选择性优势。无机能源可能维持着大多数土壤细菌的生存,这对我们理解不断变化的大气化学和微生物多样性具有深远的意义。

引言

细菌在全球土壤生态系统起着关键的支撑和调控作用。基于非培养的研究表明,土壤中蕴藏着丰富多样的细菌群落,其中大多数细胞由于资源限制等环境压力被认为处于休眠状态。大多数土壤细菌使用来自植被和其他的有机碳作为能源和碳源。能佐证这一点的是,从土壤中最丰富的所有9个细菌门中的分离出的细菌,它们都是好氧有机营养型微生物。然而,已经鉴定出了许多使用无机物包括氢气(H2)、一氧化碳(CO)、硫化物、硫代硫酸盐、氨和亚硝酸盐等作为能源的细菌。与有机营养型的微生物相比,尽管这些细菌在生态和生物地球化学过程中发挥关键作用,但它们通常被认为是次要的群落组成部分。

越来越多的证据表明,痕量气体H2CO和少量的甲烷(CH4)是细菌生长和生存特别重要的能量来源。这三种气体普遍存在于大气中,全球平均浓度分别为0.530.101.85 ppmparts per million)。由于自然和人为活动的影响,其中局部CO水平变化很大。这些气体可以在土壤中产生:H2可通过生物固氮和发酵产生;CO主要通过非生物过程和光化学过程产生;而CH4则主要通过微生物产甲烷过程产生。从生物地球化学的角度来看,土壤细菌是还原性痕量气体的主要汇,每年H2COCH4(不包括湿地)的净损失占大气中的H2(每年7000万吨)、CO(每年25000万吨)和CH4(每年3000万吨)的比例分别为75%10%5%。微生物已经进化出一些如[NiFe]-吸氢酶,[MoCu]-一氧化碳脱氢酶和甲烷单加氧酶等金属酶来氧化这些气体。一些细菌通过利用源自H2CO的电子来驱动各种途径的有氧呼吸和碳固定来维持自养或混合营养生长。此外,基于细菌培养实验结果,来自四个门(放线菌门,变形杆菌门,酸杆菌门,绿弯菌门)的细菌会在碳源限制的条件下从有机营养型生长转变为使用这些痕量气体维持生长。遗传学研究表明,这种代谢灵活性为细菌在资源可用性或稳定性较低的条件下提供选择优势。

尽管取得了上述研究进展,但我们对痕量气体和其他化合物在维持土壤微生物生存的能源和碳源的相对贡献方面依然缺乏全面的了解。有些人猜测,痕量气体氧化菌可能在土壤微生物群落中广泛分布。但是,据以前的土壤微生物研究显示,与甲烷氧化菌占比类似,具有氧化大气中的H2CO能力的微生物是比较稀少的,仅占细菌总群落的1%。值得注意的是,在某些极端环境条件下,比如在光合作用输入量较低的南极荒原土壤中痕量气体氧化菌是其主要初级生产者。本文结合了宏基因组学、生物地球化学和热力学建模方法来描述土壤细菌的代谢策略。与先前的推断相反,本文发现兼性痕量气体氧化菌是土壤微生物组中高丰度且高多样性的成员。此外,这些细菌能以较快的速率消耗痕量气体以维持其基本能量需求。

结果与讨论

大多数土壤细菌具有氧化有机和无机能源的灵活性

首先,对澳大利亚四个土壤生态系统(湿地、草地、森林、旱地)的不同深度的剖面的土壤样品进行了宏基因组测序,并分析了全球另外8个地点的宏基因组数据。经过组装和分箱共产生757个高质量或中等质量的宏基因组组装基因组(MAGs),涵盖26个细菌门和5个古细菌门。其中一半的基因组属于全球优势土壤类群,包括放线菌门、变形菌门和酸杆菌门。

使用附表5中综合参考数据库,在宏基因组短读序列(shortreads)和MAGs中搜索关键的代谢基因(图1)。正如预期的那样,大多数细菌可通过有氧呼吸分解有机物来产生能量。许多细菌还编码消耗痕量气体H2CO的关键酶,其中Group 1Group 2 [NiFe]-氢化酶和I型一氧化碳脱氢酶平均分别占总short reads39%56%,分别占组装基因组的31%26%。同样较为普遍的是代谢硫化物(28% reads / 22% 基因组)和硫代硫酸盐氧化(6.2% / 11%)的能力,而亚硝酸盐(4.6% / 3.7%)、铵(1.5% / 2.4%)、甲烷(1.1% / 0.37%)氧化和光合作用(1.3% / 1.5%)的能力则相对较弱(图1)。总的来说,平均有72%的细菌基因组编码通过无机底物获取能量的酶。对于电子受体的利用,大多数细菌编码用于有氧呼吸的末端氧化酶,并且根据预测,许多细菌可以通过硝酸盐还原(25% / 14%)、亚硝酸盐还原(21% / 21%)和产氢发酵(29% / 21%)来产能(图1)。与上述结果一致,对于三个全球站点的宏转录组数据(附表2)分析发现,编码末端氧化酶的呼吸相关基因的表达量最高(594 TPM),其次高表达的还包括氧化NADH198 TPM)、H2126 TPM)、CO75 TPM)和铵盐(223 TPM)的基因(附表8)。总之,上述结果表明,大部分土壤细菌是代谢灵活的有机异养菌,它们可编码并表达利用替代能源(如痕量气体)的酶来补充能源需求。

图1 全球土壤细菌的能量存储和碳捕获机制

使用同源搜索的方式检测宏基因组短序列和宏基因组组装的基因组中关键代谢过程的标记基因。(a)热图显示了四个澳大利亚位点和八个全球位点中宏基因组短序列的每个基因的丰度。基于对单拷贝标记基因的归一化,显示了预计编码一个过程的每个基因中至少一个的总群落的百分比。检测到的基因通常基因组中以单拷贝形式存在,将执行类似功能的基因折算在一起时,这些值的总和为100%。(b)散点图显示了757个宏基因组MAGs的代谢潜力。每个点的大小表示每个门中编码目标基因的基因组数量,着色表示平均基因组完整性。物种分类基于GTDB。
不同土壤生态系统中的多个细菌门能氧化H2COCH4

为了深入了解痕量气体氧化菌的系统发育多样性,我们从分箱和未分箱的组装序列中生成了氢酶和一氧化碳脱氢酶的系统发育树(附表9)。19个细菌门可编码一种或两种酶,包括9个土壤中的优势菌门(酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、芽孢杆菌门、浮霉菌门、变形菌门、疣微菌门)和6个候选菌门(BinatotaDormibacterotaEremiobacterotaMethylomirabilotaTectomicrobiaUBP7)。其中有49%的氢酶属于1h [NiFe]-氢化酶,这种相对较新发现的高亲和力酶可以通过氧化大气中的H2来维持有机营养细菌的生存。系统发育树显示1h [NiFe]-氢化酶具有前所未有的序列多样性和广泛的分类学分布,序列隶属于13个门(图2a)。同样广泛存在的还有1d [NiFe]-氢化酶(8.9%)、1f [NiFe]-氢化酶(19%)和2a [NiFe]-氢化酶(3.6%)。对于CO脱氢酶,由于没有强有力的证据表明COII型酶的相关底物,因此仅使用经典的I型酶在参考数据库中进行检索。结果表明,在MAGsICO脱氢酶同样是普遍存在的(图2b)。

图2 最大似然系统进化树

该图显示了与痕量气体氧化相关的关键酶的序列多样性和分类学分布。显示了(a)group1和2的[NiFe]-氢化酶大亚基和(b)[MoCu]-一氧化碳脱氢酶大亚基(CoxL)的氨基酸序列。系统进化树显示了来自MAGs的序列(用颜色代表分类名称:167个氢化酶序列,141个CO脱氢酶序列)以及NCBI参考基因组中的代表性序列(用灰色表示的分类名称:168个氢化酶序列,171个CO脱氢酶序列)。预计能够进行采样土壤中痕量气体氧化的氢化酶亚组和一氧化碳脱氢酶的进化枝进行了高亮显示。两树都是使用基于JTT矩阵模型构建的,使用了所有位点,并通过50个重复进行引导。

此外,系统发育分析也证实了硫化物、硫代硫酸盐、氨、亚硝酸盐和甲烷氧化菌的存在及其分类关系(附图510;扩展数据图3)。其中包括土壤完全氨氧化(comammox)细菌和最近报道的潜在亚硝酸盐氧化候选门(Eremiobacterota)。一个重要发现是组装并预测出了Gemmatimonadota可以利用甲烷、氢和醋酸盐作为能源,这表明Gemmatimonadota是第四个潜在的好氧甲烷氧化菌门。

痕量气体氧化菌在不同的土壤生态系统及深度下都具有很高的活性

根据痕量气体氧化菌的的丰度和多样性,证实了其在所有被调查的澳大利亚土壤生态系统中都是活跃的。对于H2COCH4的原位浓度以及大气-土壤界面的交换通量,选取四份平行生物样本,使用灵敏的气相色谱仪在四个位点进行了测量。上述三种气体浓度在大气-土壤界面和每个土壤样本的顶部二十厘米均处在典型的混合比例之间,证明它们都可以作为细菌利用的底物(图3a)。在某些位点,土壤中气体浓度随着深度而减小(附图4),这可能是微生物消耗所致。除此之外,在一些土壤剖面中也发现了潜在的证据表明有内源性气体的产生:较深的湿地土壤中含有高浓度的H2可能是缺氧环境下,许多产氢发酵菌所致;而旱地土壤中气体含量的升高与光化学及热化学产生过程一致。反过来,内源性气体的产生也可能会导致土壤中这些气体的循环利用,当然究竟是否如此,还需要实验证明。与H2氧化菌的丰度分布一致,所有位点的土壤群落中都观测到了H2的原位吸收,其中草地、森林和湿地对H2的消耗尤其迅速(图3b)。通量室中的H2被下层土壤氧化,在几分钟之内浓度就下降至约0.1ppm的阈值,这种情况下H2的通量在-10-40 nmol·m-2·s-1。与H2相反,并没有观测到关于CO的明显通量变化,推测是白天发生的高速率光化学产CO过程掩盖了微生物对CO的消耗,不过这仍有待实验证实。除森林土壤外,其余所有位点CH4的吸收量都比H2要低。对照实验已经证实,通量室是气密的,在测量通量过程中不会影响气体的产生与消耗。总体来说,虽然土壤中内源性气体的产生可能掩盖了大量气体消耗,但是观测到的痕量气体通量仍然远低于已报道的异养生物呼吸作用所产生的通量。

随后,在含有环境顶部空气的培养瓶中培养土壤深度剖面的样品来测量非原位氧化速率。在上述条件下,如果不考虑非生物来源的气体产生,生物气体消耗量是可以被准确测量出来的。大气中的H2CO都迅速地被森林、草地和湿地土壤氧化,其速率是之前文献所提出的五倍以内。虽然细胞特异速率(根据估算相应痕量气体氧化菌数量来进行标准化)随深度的变化很小,但是在大部分土壤样品中,表层土壤(0-50-10 cm)的氧化速率都显著高于深层土壤(15-2025-30 cm)。在这些位点中,大气CH4的平均氧化速率比H276倍,比CO35倍,而其中森林土壤对CH4的消耗最快。这与宏基因组中吸氢酶与一氧化碳脱氢酶相比甲烷单加氧酶含量更高的结果相一致(图1)。与原位观测结果一致,旱地土壤的痕量气体氧化速率是最慢的。而之前的实验室研究也证明,低含水量会抑制痕量气体的吸收。与其他环境相反,深层旱地土壤对痕量气体的消耗更快,这可能说明深层旱地土壤的含水量较高。在实验室中,将旱地土壤湿润以模拟降雨情况,发现土壤对痕量气体的消耗速率平均提高了60倍(图3c)。总之,这些基于活性的测量结果作为宏基因组分析的补充,证实了土壤中含有高活性的H2CO及有时也含CH4的氧化菌。尽管原位气体通量(尤其是CO)通常较低或者变化较大,迅速的异位速率及以前报道的内源性气体均表明高水平的内部气体循环是存在的。

图3 澳大利亚的四个土壤生态系统中痕量气体氧化的测量

a)每个生态系统(湿地、草地、森林、旱地)的现场气体的深度分析和浓缩,其采集深度为0-16 cm。(b)现场土壤-大气气体通量(Jatm;正值表示净气体生产,负值表示净气体消耗)。虚线表示模拟通量检测上限和下限,大多数CO和CH4通量值都落在其中。对于a和b,每个生物群落在四个分开的土壤样品中进行测量,误差线显示标准差。(c)用细胞的异位氧化速率在四个不同深度(0-5、5-10、15-20、25-30 cm)的样品核心生态系统进行深度测定和分辨。对每种土壤生态系统和处理(旱地)进行四个生物学重复实验。根据16S rRNA基因qPCR,将氧化速率值标准化,可用来预测痕量气体氧化菌的总细胞数,基于其群落百分比计算每种气体氧化量。(d)每个细胞通过各痕量气体氧化产生的能量值,是使用热力学模型根据每个栖息地四个深度的异位速率计算得到的。左侧不同带色表示了不同纯培养物(绿、黄、蓝)以及深海沉积物氢氧化菌(粉红)的能量需求或内源代谢率的文献值范围。对于c和d的箱形图,显示数据分别是平均值,上、下四分位数以及最小值和最大值。

痕量气体的存在使得大量土壤细菌可以生存并且可能为混合营养型生长提供了支撑

痕量气体的氧化很可能主要是支撑有机营养型细菌的生存。大部分已测序的土壤细菌可编码吸氢酶和一氧化碳脱氢酶,同时在有机营养型微生物中也存在相关的基因。基于对纯培养的研究表明,当生长过程中有机碳供应受到限制时,细菌会消耗痕量气体来为细胞功能的维持提供能源。基于异位氧化速率和每克干土中监测到的痕量气体氧化菌总量,用热力学模型估算了每个细胞可以产生的能量。估算出的氧化速率足以支撑每个H2氧化型细胞产生2.2×10-15W的能量,每个CO氧化型细胞产生2.0×10-15W的能量,每个CH4氧化型细胞产生1.1×10-13W的能量,且除了旱地土壤之外,其他生态系统和深度的变化趋势都相似(图3d)。计算得出的单个细胞产能值在之前研究的各种需氧异养菌的能源需求范围内(平均每个细胞1.9×10-15W;范围在10-1210-17W之间),远远高于高度能量限制生态系统中需氧异养菌的原位维持能量值(每个细胞10-1710-19W)。之前的研究根据观测到的氧化速率和单一静态维持能量假设,估算了痕量气体氧化菌的理论最大群落。虽然我们的实验观察菌群的结果与这些估计有一定的一致性,但是与维持能量的假设却不那么相似。文献数据和我们基于经验值计算出的细胞特异性产能结果表明,代谢速率在不同的微生物群落、不同的代谢策略以及土壤环境之间存在很大的差异。因此,用单一维持能量的假设来估算依靠相应痕量气体生存的细菌比例,这样的模型可能太过简单。需要指出的是,我们的估算结果并没有考虑到残留DNA、不活跃的细胞以及内部气体循环。所以,原位的总氧化速率和每个细胞产生的能量值都可能更高。总的来说,这在理论上表明,仅需痕量气体就可以支持整个痕量气体氧化菌的生存。

痕量气体也可能支持土壤中相当一部分混合营养型的细菌生长。从分析结果可以看出,群落中大部分菌群,包括痕量气体氧化菌主要是通过异养方式来获取碳的。但是某些细菌(占reads13% / 占基因组的12%)能够编码通过卡尔文循环吸收CO2的酶(图1)。由基因组分析可知,这些自养微生物大部分都能够氧化H279%)和(或)CO63%),有的还具备硫氧化(32%),硫代硫酸盐氧化(17%),或者光合作用的能力(11%)。假定的自养型H2CO氧化菌在7个土壤优势菌门和候选菌门Dormibacterota中都有分布,这表明许多菌群都具有自养能力(图1)。与之相应的,系统发育树分析结果表明,能够产生1,5-二磷酸核酮糖羧化-氧化-酶(RuBisCO / RbcL)的93%的种群都来自那些能够进行化能合成而非光能合成的分支。其他的CO2固定途径也有被检测到,但是除了泥炭地,其他的环境中含有相应基因的种群不到1%(图1)。尽管有越来越多的证据表明那些含量很低的痕量气体可以用于支撑混合营养型生长,但是也因为含量过低,人们认为它不足以作为维持生物生长的单一能量来源。此外,自养生长在土壤气体产生速率较高的环境中可能是较有利的,比如缺氧状态下的氢发酵土壤。值得一提的是,这表明最近在南极荒漠地区发现的这种利用大气痕量气体进行化能合成作用的生物过程也延伸到了其他生态系统。

结论与展望

总体来说,具有代谢灵活性的细菌,可以同时利用有机与无机能源,在土壤中可能存在选择性优势。在大多数土壤中,有机碳是限制微生物生长的主要因素;这反映了土壤可利用有机碳固有的时空变异性、许多有机高分子聚合物的抗降解性以及对更易降解组分的激烈竞争性。因此,利用选择性能源的能力可能对许多类群的适应性和恢复力有着决定性的影响。H2CO是此方面较为理想的化合物,因为它们很容易从大气和土壤中获得;同时,它们的高含能量、低活化能和以扩散的方式进入微生物细胞使得这些气体能很好的维持细胞生存。

这些发现反过来表明,这些痕量气体的氧化是一个多方面的过程,而不是之前所说的是某一特定方面的过程。我们提供了多层面的证据,表明了H2CO的氧化菌在不同土壤生态系统与深度都具有丰富性、多样性和活跃性。这些发现与一些之前发表的关于表明痕量气体氧化菌只占生态群落1%的报道形成鲜明对比。这种差异也许反映出了如下问题:之前针对大气中H2氧化菌的工作是根据非兼并性的定量PCR引物进行的,而这些引物只能捕获土壤吸收氢酶多样性的一小部分;事实上,我们在加拿大农田宏基因组中观察到高亲和力氢酶(30% reads / 40% 基因组)的占比很大,而人们先前推断这里的H2氧化菌是占比较小的。此外,尽管之前的基因组调查表明放线菌主要调节大气中H2氧化。我们的分析表明所有土壤优势细菌门均可以调节这一过程。然而,一个重要的警告是,我们的发现主要是基于基因组推断和土壤速率,这意味着不清楚是否所有假定的痕量气体氧化菌在实验中都是活跃的。代谢灵活的“多面手”与更专一化的类群共存,这些类群预计会使用更多的生境基质,包括甲烷、氨和亚硝酸盐。某些Gemmatimonadota的好氧甲烷氧化编码基因的发现进一步说明了土壤中痕量气体氧化菌的多样性。我们的结果也揭示了土壤中化能自养生物出人意料的多样性和丰度,同时暗示了硫基化合物具有进一步补充能源的作用。

热动力学分析表明,痕量气体的氧化足以维持土壤中所有的痕量气体氧化菌的生存,因此大多数痕量气体氧化菌存在于土壤中。每个细胞的能量值都在纯培养的维持或内源性能量范围内,超过了能源限制生态系统的范围。然而,在单个细胞氧化痕量气体的速率以及分配这一过程中产生的能量的方式上,可能存在相当大的异质性。例如,虽然一些编码吸收氢酶的细胞最低限度地使用氢气,但许多其他细胞将依赖氢气生存,而另一些细胞可能利用氢气进行生长,这些都是看似合理的。还需要注意的是,大多数携带痕量气体氧化基因的细菌被预测在代谢方面上是具有灵活性的。它们中有许多可能同时消耗有机和无机能源,或者实际上是同时消耗几种微量气体,以便以混合营养方式生长或者维持生存。关于痕量气体在细菌种群和细胞内部(之间)是如何被差异利用还需进一步地进行创新性研究。

更有意义的是,这里所描述的大量的土壤-大气相互作用似乎对土壤生物多样性和大气化学具有关键的调节作用。土壤细菌消耗来源自大气、生物和地球化学的痕量气体。由于痕量气体是维持大多数土壤休眠的主要能源,因此痕量气体的氧化将反过来对群落生态产生深远的影响;事实上,休眠有助于维持微生物的生物多样性和土壤群落的恢复力。此外,痕量气体氧化菌的数量和种类比以前认为的要多,这一观察结果表明,全球大气中H2CO的汇是相对有弹性的。这也许可以解释为什么尽管H2的人为排放量很高,但全球混合比率仍然十分稳定。然而,各种人类活动,例如通过改变土壤属性(如农业实践和荒漠化)和大气成分(如通过城市污染或氢气经济),可能破坏这种土壤-大气相互作用,产生潜在的生态和生物地球化学后果。需要进一步研究,了解哪些理化因素影响痕量气体氧化菌的丰度和活性,以及它们对区域与全球变化的响应。我们还需要做更多的工作来了解土壤痕量气体氧化菌在化能固碳中的作用,从而确定这一过程是否可以作为一个重要的CO2的汇。


本文译者

中山大学海洋科学学院本科生:翁生泽、冯征淇、谭吕晏、闫驰。


特别鸣谢

中国科学院南京土壤研究所博士生徐勇峰对本文的修改。

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