类器官的火热程度不用我多说，Pubmed上搜一下就可以看到已经呈现井喷的模式，在这些文章中，以Hans Clevers教授的研究最为出色。
今天跟大家分享的就是2020年Hans教授在Nature Protocols杂志上发表的关于PDO培养和药敏实验的文章。
文章的三位作者都来自荷兰胡布勒支研究所，这是一个享誉全球的研究所，隶属于荷兰皇家艺术与科学院，该所有23个课题组，主要的研究方向集中在发育和干细胞生物学。
文章的通讯作者就是大名鼎鼎的Hans Clevers，他不仅是该研究所的课题组长，还是乌特勒支大学的教授研究员。研究方向主要包括三个方向，Wnt信号通路、干细胞生物学及类器官技术的研发。我查了Hans Clevers的代表文章，单CNS三大杂志就发表了50篇文章，厉害厉害！
先介绍一下PDO建立的基本流程，首选获得组织，组织类型主要是三种：正常组织、肿瘤组织和活检组织。针对手术切除的组织在消化解离前需要先剔除没用的部分，也就是脂肪和肌肉组织。剔除之后进一步进行消化解离，取一部分保存进行分子生物学实验，剩余部分包裹在BME胶中，然后滴注到培养板上形成PDO，生长到一定程度之后进行传代和药敏实验。
作者在文章中以口腔粘液瘤为例进行了详细展示，首先取到组织，去除脂肪和肌肉组织后，用胰酶消化，每隔十分钟振荡重悬，解离时间不超过60分钟，然后用大量的培养基重悬，过100μm孔径的细胞筛，未消化完全的部分留在了细胞筛上方，用培养基清洗以去除胰酶，然后离心，用冷BME重悬，迅速滴注点板，BME胶凝固之后添加培养基进行培养，在第0、3、7天观察PDO的生长情况。
下面我们来拆解一些细节。
培养基
用于PDO培养的培养基的主要成分主要分为两类：一类是基础培养基，一类是另外添加的各种因子。
作者综述了近年来多篇文章的培养方案，发现在所有方案都选用DMEM/F12培养基作为基底，究其原因是因为DMEM/F12培养基适合克隆培养，还有较为丰富的营养因子。基础培养基之外的添加因子就会随着肿瘤类型的不同而发生变化，但基本上都会包含着四类因子：
1、Wnt信号通路激活剂；
2、酪氨酸受体激酶的配体，刺激上皮细胞增殖；
3、TGF-β信号通路抑制剂，抑制上皮细胞分化；
4、ROCK抑制剂，保持干细胞多能性。
PDO培养是3D培养，常用胶的类型主要为三种：R&D公司的BME，BD公司的Matrigel以及Sigma的Geltrex。这里主要介绍一下我们在用的BME胶，其实这是一种从小鼠肉瘤细胞中纯化出来的一种可溶性基底膜，低温条件下呈液态，37℃呈现固态。BME包含多种组分，对于维持干细胞或前体细胞未分化状态有重要作用，并不是单纯提供一种固态支持的作用。
消化解离
作者综述了33种已报道的组织消化解离的方法，主要是用机械破碎+酶消化的方法，用的比较多的是胶原酶、胰酶、DNA酶和解离酶，需要注意的是不同组织用到酶不同，消化时间也不同，肠类器官通常不要超过60min，否则会解离过度，而肝类器官则要解离2h，甚至过夜。
之后作者将HNSCC的PDO培养做了一个长达89个步骤的建立过程，这89个步骤又可以分成9个大步骤，我把他们放在下面的图中。具体的操作我们在前面也已经有了大体描述，我只把作者提出的关键点和需要万分注意的点放在图片里。
最后我们做一个总结：PDO建立成功与否很大程度上取决于取到的组织标本，新鲜组织还有丰富上皮组织的样本更容易培养出PDO，所以各位同学要在前期把工作做好，样本保持在4℃ DMEM/F12培养基中，并添加10μM的Y-27632能够更好的保持细胞活性。
以上就是这篇文献的分析，相应的PPT也为大家准备好了，只需要将本文分享到朋友圈并在公众号对话框回复“PDO”，就能收到这份干货满满的PPT了。
参考文献：
Driehuis E, Kretzschmar K, Clevers H.Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screeningapplications. Nat Protoc. 2020 Oct;15(10):3380-3409. doi:10.1038/s41596-020-0379-4. Epub 2020 Sep 14. Erratum in: Nat Protoc. 2021 Jan12;: PMID: 32929210.
本文由科研小助手（ID：SciRes）原创，转载请注明来源
各位读者：
科研小助手官方QQ群：93646661
转载、投稿、商务合作请添加微信：amateur_1988
↓↓↓点击阅读原文查看往期精彩！