肿瘤类器官如何培养?Hans Clevers大佬在Nature Protocols分享详细方法!

类器官的火热程度不用我多说,Pubmed上搜一下就可以看到已经呈现井喷的模式,在这些文章中,以Hans Clevers教授的研究最为出色。

肿瘤类器官如何培养?Hans Clevers大佬在Nature Protocols分享详细方法!

今天跟大家分享的就是2020Hans教授在Nature Protocols杂志上发表的关于PDO培养和药敏实验的文章。

肿瘤类器官如何培养?Hans Clevers大佬在Nature Protocols分享详细方法!

文章的三位作者都来自荷兰胡布勒支研究所,这是一个享誉全球的研究所,隶属于荷兰皇家艺术与科学院,该所有23个课题组,主要的研究方向集中在发育和干细胞生物学

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文章的通讯作者就是大名鼎鼎的Hans Clevers,他不仅是该研究所的课题组长,还是乌特勒支大学的教授研究员。研究方向主要包括三个方向,Wnt信号通路、干细胞生物学及类器官技术的研发。我查了Hans Clevers的代表文章,单CNS三大杂志就发表了50篇文章,厉害厉害!

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先介绍一下PDO建立的基本流程,首选获得组织,组织类型主要是三种:正常组织、肿瘤组织活检组织。针对手术切除的组织在消化解离前需要先剔除没用的部分,也就是脂肪肌肉组织。剔除之后进一步进行消化解离,取一部分保存进行分子生物学实验,剩余部分包裹在BME胶中,然后滴注到培养板上形成PDO,生长到一定程度之后进行传代和药敏实验。

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作者在文章中以口腔粘液瘤为例进行了详细展示,首先取到组织,去除脂肪和肌肉组织后,用胰酶消化,每隔十分钟振荡重悬,解离时间不超过60分钟,然后用大量的培养基重悬,过100μm孔径的细胞筛,未消化完全的部分留在了细胞筛上方,用培养基清洗以去除胰酶,然后离心,用冷BME重悬,迅速滴注点板,BME胶凝固之后添加培养基进行培养,在第037天观察PDO的生长情况。

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下面我们来拆解一些细节。

培养基

用于PDO培养的培养基的主要成分主要分为两类:一类是基础培养基,一类是另外添加的各种因子

作者综述了近年来多篇文章的培养方案,发现在所有方案都选用DMEM/F12培养基作为基底,究其原因是因为DMEM/F12培养基适合克隆培养,还有较为丰富的营养因子。基础培养基之外的添加因子就会随着肿瘤类型的不同而发生变化,但基本上都会包含着四类因子:

1Wnt信号通路激活剂;

2、酪氨酸受体激酶的配体,刺激上皮细胞增殖;

3TGF-β信号通路抑制剂,抑制上皮细胞分化;

4ROCK抑制剂,保持干细胞多能性。

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PDO培养是3D培养,常用胶的类型主要为三种:R&D公司的BMEBD公司的Matrigel以及SigmaGeltrex。这里主要介绍一下我们在用的BME胶,其实这是一种从小鼠肉瘤细胞中纯化出来的一种可溶性基底膜,低温条件下呈液态,37℃呈现固态。BME包含多种组分,对于维持干细胞或前体细胞未分化状态有重要作用,并不是单纯提供一种固态支持的作用。

消化解离

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作者综述了33种已报道的组织消化解离的方法,主要是用机械破碎+酶消化的方法,用的比较多的是胶原酶、胰酶、DNA酶和解离酶,需要注意的是不同组织用到酶不同,消化时间也不同,肠类器官通常不要超过60min,否则会解离过度,而肝类器官则要解离2h,甚至过夜。

之后作者将HNSCCPDO培养做了一个长达89个步骤的建立过程,这89个步骤又可以分成9个大步骤,我把他们放在下面的图中。具体的操作我们在前面也已经有了大体描述,我只把作者提出的关键点和需要万分注意的点放在图片里。

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最后我们做一个总结:PDO建立成功与否很大程度上取决于取到的组织标本,新鲜组织还有丰富上皮组织的样本更容易培养出PDO,所以各位同学要在前期把工作做好,样本保持在4℃ DMEM/F12培养基中,并添加10μMY-27632能够更好的保持细胞活性。

以上就是这篇文献的分析,相应的PPT也为大家准备好了,只需要将本文分享到朋友圈并在公众号对话框回复“PDO,就能收到这份干货满满的PPT了。

参考文献:

Driehuis E, Kretzschmar K, Clevers H.Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screeningapplications. Nat Protoc. 2020 Oct;15(10):3380-3409. doi:10.1038/s41596-020-0379-4. Epub 2020 Sep 14. Erratum in: Nat Protoc. 2021 Jan12;: PMID: 32929210.

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