鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

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鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

 要:目的  基于体外代谢模型对鱼腥草Houttuynia cordata挥发油代谢产物通用客体印迹模板进行研究。方法  自制鱼腥草注射液(Houttuyniae InjectionHI),将其在大鼠肝微粒(RLM)中进行孵育,于不同时间点采集样本,进行GC-MS测定;计算所有代谢产物的分子连接性指数(MCI),并从中筛选出代谢产物的共有成分和非共有成分,总结其结构特点,运用夹角余弦法计算相似度;将所有代谢成分进行归类。结果  共得到鱼腥草挥发油代谢产物62个,其中共有成分6个,分别是十四烷、植烷、正癸酸、己酸、乙酸异龙脑酯和正己醇,除乙酸异龙脑酯外,MCI与总体代谢产物相似度较高(0.9140.964)。将非共有成分归类得到6个成分群,其平均MCI与总代谢产物MCI的相似度均较高(0.9390.999),然而各个成分群之间的平均MCI相似度差异显著。结论  以超分子印迹模板为理论指导,为鱼腥草挥发油代谢产物进行了归类。采用分子连接性指数和夹角余弦法,表征了鱼腥草挥发油代谢通用客体印迹模板”
鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分,始载于《名医别录》。作为广泛应用的传统中药,具有清热解毒、消肿疗疮、利尿除湿的功效。现代研究发现其主要化学成分为挥发油类、黄酮类、有机酸、脂肪酸、氨基酸以及生物碱类成分[1]。其中挥发油类成分为主要药效成分,其鲜草含挥发油0.049%,主要有鱼腥草素,即癸酰乙醛、癸醛、月桂醛及甲基正壬酮等成分[2-6]
临床上曾广泛应用的鱼腥草注射液(Houttuyniae InjectionHI)是从鲜鱼腥草中用水蒸汽蒸馏法提取的挥发油类成分[7],加入增溶剂聚山梨酯-80及氯化钠调节为等渗溶液,滤过后灭菌而成,具有抗菌、抗病毒以及增强机体免疫力的药理作用,用于治疗上呼吸道感染、急性化脓性扁桃体炎、急性慢性支气管炎、肺炎等呼吸道疾病、尿道炎、肾盂肾炎等泌尿系统疾病以及各种皮肤感染等疾病[8‑10]。鱼腥草的有效成分为挥发油,是多成分体系[11‑13]。目前,关于鱼腥草挥发油的代谢产物鲜有报道,且没有将这些代谢产物进行归类总结。
超分子化学,即“超越分子的化学”,由J M Lehn提出,是分子间键的化学,涵盖由两个或两个以上化学成分缔合形成的实体的结构和功能,用于研究分子自识别、自组装等现象[14]。中药超分子化学理论认为,中药与人体均为自然界生物超分子体,其药效基础为生物超分子“印迹模板”的聚集体,进入人体后按超分子自主印迹行为发挥药效作用[15],代谢产物也同样适用[16]。“印迹模板”理念起源于Fischer的酶与底物作用的“锁钥模型”及Pauling的“抗体-抗原”学说,可解释配体-受体理论,属超分子化学中主-客体化学研究范畴,具自组装、自组织、自识别与自复制的特点[17]。“在空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物”即为超分子“印迹模板”,对中药成分来说既是其分子结构的空间活性结构,也可以说是活性原子团的空间排列点阵,据此可从化学物质的本源上阐明主-客体分子自主作用的普遍规律。
因此,本实验通过自制HI,首次研究HI中的挥发油在大鼠肝微粒体的代谢产物及其特点,以超分子“印迹模板”为理论[16,18‑20],结合分子连接性指数(MCI[21],探索其代谢通用客体的“印迹模板”规律,对指导鱼腥草临床合理用药及其配伍具有重要意义,为中药代谢产物“印迹模板”的研究奠定基础。

1  材料

1.1  药品与试剂

新鲜鱼腥草8批,购于湖南中医药大学含浦校区周边村庄或菜市场,按照采购时间批次编号依次为YXC01YXC08,经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为三白草科蕺菜属植物蕺菜H. cordata Thunb.的新鲜全草。
对照品甲基正壬酮(批号110834-2005020.1 mLGC测定质量分数≥98%)、正十五烷(批号11677-200401100 μg/mL)、乙酸龙脑酯(批号110759-2011050.2 mLGC测定质量分数≥97%)及α-蒎烯(批号897-20000011 mgGC测定质量分数≥98%)均购自中国食品药品检定研究院;正已烷,批号K46764991524,色谱纯,购自德国默克股份有限公司;KH2PO4K2HPO4KCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-DH)、MgCl2(NH4)2SO4均购自Sigma公司;乙腈、甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯;水为超纯水。

1.2  动物

雄性SD大鼠,SPF级,体质量200220 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2011-0003。本研究依照湖南中医药大学伦理委员会的要求执行,动物实验经湖南中医药大学伦理委员会批准(伦理编号LLBH-201107230003)。

1.3  仪器

CM-230超纯水系统,北京帕思特科技有限公司;GCMS-QP2010型气质联用仪,日本岛津公司;CP-114电子天平,奥豪斯仪器上海有限公司;98-1-B型电子控温电热套,天津市泰斯特仪器有限公司;1000 μL100 μL移液枪,济南好来宝医疗器材有限公司;20 mm球形冷凝管,天津市奥淇洛谱商贸有限公司;500 mL挥发油提取器,天长市吉高实验设备有限公司。

2  方法

2.1  HI样品制备

取新鲜鱼腥草全株,除去泥沙、根及烂叶,称取2000 g,用剪刀剪碎成23 cm的小段,置于单口圆底烧瓶中加水浸没药材。水蒸气蒸馏,收集初次蒸馏液2000 mL,再进行重蒸馏,收集重蒸馏液约1000 mL,加入7 g氯化钠及5 g聚山梨酯-80,混匀,加注射用水使成1000 mL,使用0.45 μm0.22 μm的滤芯进行滤过,灌封,115 ℃灭菌30 min,即得HI

2.2  肝微粒体实验溶液配制

2.2.1 PBS液配制  精密称取KH2PO4K2HPO4KCl粉末分别配制成1 mol/L的溶液,并配制EDTA饱和溶液(100 mmol/L),用移液管量取40.1 mL K2HPO4溶液,9.9 mL KH2PO4溶液,60 mL KCl溶液,5 mL EDTA溶液,加水至500 mL,调整pH值为7.4,即得PBS液。

2.2.2 G.S800 mL)系统溶液的配制  NADPG-6-PG-6-P-DHMgCl2(NH4)2SO4分别配制成65 mmol/L165 mmol/L500 U/mL165 mmol/L2.6 mol/L的溶液,向离心管中分别加入去离子水528 µLG-6-P溶液80 µLG-6-P-DH溶液32 µLNADP溶液80 µLMgCl2溶液80 µL,配制成G.S800 mL)系统溶液。

2.3  大鼠肝微粒体制备

实验前大鼠控制饮食1周,并于实验前禁食不禁水24 h。将大鼠固定在木板上,并用细线把大鼠四肢及头部固定。用剪刀将大鼠腹部打开,快速找到肝脏;用另一把消毒冷藏过的剪刀将肝脏整个剪下来,不能带有除肝脏外的其它任何部分,用冰水洗净,称定质量。按14比例(1 g肝组织、4 mL PBS液)将肝组织研碎,倒入50 mL离心管,以     9000×g4 ℃离心20 min后快速取上清,再以恒温4 ℃、100 000×g离心90 min,取下层粉红色沉淀,即为大鼠肝微粒体,按照体积比13向肝微粒体中加入储存液(750 mL PBS250 mL甘油)后,分装于离心管中−80 ℃下保存备用。

2.4  孵化反应

向管中加入25 μL HI(空白组加蒸馏水),40 µL的磷酸盐缓冲液(pH7.4),20 µL肝微粒体和60 µL双蒸馏水,37 ℃恒温水浴锅预孵化10 min。加入G.S液启动反应,并继续在37 ℃孵育,于103045607590120150 min取样品。平行3组进行实验。

2.5  体外代谢样品的制备

在样品中加入22.0μg/mL正十五烷(内标),用800μL氯仿-异丙醇(9∶1)萃取,涡旋振荡1 min3000 r/min离心10 min,取上清液进行GC-MS测定。

2.6  GC-MS分析条件

2.6.1  气相色谱条件 色谱柱为石英毛细管柱Rtx-5ms30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序:初温为60 ℃,以2 /min升至140 ℃,保持5 min,再以10 /min升至200 ℃,保持9 min;分流比30∶1;载气为高纯He99.999%);载气流量为1.0 mL/min;气化室温度为250 ℃。

2.6.2  质谱条件 离子源为EI源;离子源温度为230 ℃;四级杆温度为150 ℃;电子能量为70 eV;接口温度为280 ℃;溶剂延迟2.5 min;质量范围为m/z40500

3  结果

3.1  鱼腥草挥发油代谢产物信息

根据GC-MS结果,只采用2组理想的实验数据进行展示并分析。扣除空白溶剂峰,整理得到每个时间段各个峰的峰面积以及频数,共得到鱼腥草挥发油代谢产物62个,结果见表1,其中S1S2来自YXC01S3S4来自YXC02S5S6来自YXC03S7S8来自YXC04S9S10来自YXC05S11S12来自YXC06S13S14来自YXC07S15S16来自YXC08

鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

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3.2  鱼腥草挥发油代谢共有产物

将频数≥1590%批次数,本实验批次数为16)的成分视为共有成分,共得到6个共有成分,按相对质量分数从高到低排序分别为十四烷(7.15%)、植烷(6.65%)、正癸酸(3.10%)、己酸(0.41%)、乙酸异龙脑酯(0.18%)、正己醇(0.13%),且大都为简单直链结构,由芳香环、酯类等复杂的结构经过肝微粒酶代谢转化而来。由表2可得,共有成分的保留时间分布大致均匀。本实验只展示MCI零阶、一阶和二阶的值。采用夹角余弦法计算相似度,得到共有成分的MCI与总代谢产物相似度普遍较高,可以代表鱼腥草挥发油总代谢产物的“印迹模板”。乙酸异龙脑酯的相似度较低,可能是由于乙酸异龙脑酯具有较复杂的带环立体结构,观察各个成分结构可知,大致包含烷烃、醇类、酯类、醛酮类等成分,且结构较为简单。众所周知,MCI值与分子拓扑结构有关,分子结构的细微差异,会在MCI各阶出现相应的变化,这可能是导致乙酸异龙脑酯MCI相似度较低的原因。

鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

3.3  鱼腥草挥发油代谢非共有成分归类

将非共有成分归类至共有成分中:以2个共有成分之间频数最小的成分为界限,若其频数为单数,则划为前1个成分群,若为双数,则划为后1个成分群。共得到6个成分群的“印迹模板”,组成鱼腥草挥发油代谢通用客体“印迹模板”,将保留时间范围和平均MCI列于表3。成分群1以正己醇为代表,大多为简单醇类、酯类、酮类成分;成分群2以己酸为代表,大多为烷烃、醇类、醛酮类和酸类成分;成分群3以乙酸异龙脑酯为代表,大多为烷烃、烯烃、醇类、酮类和酯类成分;成分群4以正癸酸为代表,含烷烃和酸类成分;成分群5以十四烷为代表,主要含烷烃、烯烃成分;成分群6以植烷为代表,主要为烷烃、醇类和酸类。

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3.4  鱼腥草挥发油代谢通用客体印迹模板研究

6个代谢成分群的“印迹模板”进行相似度比较,如表4所示,各个成分群与总成分的相似度较高(0.9390.999),由此可以发现,虽然单个共有成分(乙酸异龙脑酯)与整体“印迹模板”的相似度较低(0.786),但其所在的成分群3的相似度却是最高的(0.999),即各个成分群更能代表整体代谢产物的“印迹模板”。各成分群之间的相似度范围在0.8320.990,其中成分群1与成分群4的相似度最低(0.832),说明这2个相互独立;成分群32的相似度最高(0.990),说明这2个成分群联系紧密。可以得到,鱼腥草挥发油代谢产物的“印迹模板”之间是相互联系又相互独立的,它们共同组成了鱼腥草挥发油代谢通用客体的“印迹模板”。

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4  讨论

本研究基于超分子化学“印迹模板”自主作用规律,以鱼腥草挥发油体外代谢产物为主线,研究了单成分分子连接性指数、成分群分子连接性指数、总体分子连接性指数之间的关系,采用夹角余弦法计算相似度,表征不同鱼腥草挥发油体外代谢产物“印迹模板”之间的特征差异,在此基础上,最终锁定了能够代表鱼腥草挥发油体外代谢产物“印迹模板”的成分群。
采用代谢产物逼近法,筛选得到16组鱼腥草挥发油的代谢共有产物6个,分别为十四烷、植烷、正癸酸、己酸、乙酸异龙脑酯、正己醇,除乙酸异龙脑酯外,其余成分MCI与总代谢产物的相似度普遍较高,说明这些共有成分在总体代谢产物中极具代表性,可能是发挥药效的潜在成分。将其它非共有成分人工划分为6个成分群(“印迹模板”),通过观察各成分群的分子结构,可以发现每个成分群内的结构总体相似,但各成分群之间又存在差异,预示着各个成分群的独立性。它们与总代谢产物的MCI相似度均较高,说明该划分方法的可行性,表明这6个成分群可能为鱼腥草挥发油体外代谢产物“印迹模板”。此外,各成分群之间的MCI相似度范围在0.8320.990,说明各成分群(“印迹模板”)之间既是相互联系又是相互独立的,如成分群1与成分群4的相似度最低(0.832),表明这两个相互独立;成分群32的相似度最高(0.990),表明这两个成分群联系紧密。综上所述,这6个成分群能够代表鱼腥草挥发油代谢通用客体的“印迹模板”。以超分子“印迹模板”为理论,确定并划分了鱼腥草挥发油代谢成分群,得到了鱼腥草挥发油代谢通用客体“印迹模板”。同理,该法可用于中药体外代谢产物“印迹模板”的研究,探索中药成分在体外代谢的规律。由于“印迹模板”是发挥生物效应的基础,因此,通过筛选共有成分,锁定发挥效应的成分群(“印迹模板”)的个数,有利于确定中药成分中发挥效应的成分及成分群,为寻找中药药效成分奠定基础。然而,本实验为鱼腥草挥发油肝微粒体体外代谢实验,该法是否可用于中药体内代谢产物“印迹模板”的研究还需进一步验证。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献(略) 

来  源:周燕子,王敏存,贺玉婷,李海英,陈定芳,潘  雪,周逸群,贺福元鱼腥草挥发油体外代谢通用客体印迹模板研究  [J]. 中草药, 2021, 52(1):75-81.

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