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领悟科研,优人一步!今天给大家分享的是晨星计划学员美丽老师,带来的是2019年3月发表在molecular cancer的一篇文章,影响因子为15.302

题目四要素

题目:Hypoxic BMSC-derived exosomal miRNAs promote metastasis of lung cancer cells via STAT3-induced EMT
疾病:肺癌
表型:转移+EMT
主变量:miR-193a-3p, miR-210-3p and miR-5100
效应变量:STAT3
供体细胞:BMSCs
受体细胞:lung cancer Cells(LCCs)
交通工具:外泌体

科学假设

【肺癌】中,【BMSCs】在低氧情况下,可以通过【外泌体】传递【miR-193a-3p, miR-210-3p and miR-5100】,阻断【STAT3的结合】进而介导【EMT/侵袭/迁移】
【背景介绍】
肺癌具有高度致死性。既往有报道,外泌体可能参与到肺癌的发生发展。而干细胞,由于多向分化潜能,从而促进癌症的恶性程度。那么BMSC是否能够与肺癌之间存在细胞交互作用,尚未可知。

图表信息解读

01

细胞交互论证

【BMSCs低氧状态下与肺癌细胞与侵袭/转移的关系(动物层面+细胞层面)】

图1. 低氧状态下,BMSCs可以通过分泌外泌体的方式,促进肺癌细胞的侵袭和转移

A.裸鼠成瘤实验,联合BMSCs与肺癌细胞培养组,其成瘤组织明显大于单纯注射肺癌细胞组。
B.肺组织转移模型实验,观察到联合BMSCs与肺癌细胞培养组,肺组织转移情况明显大于单纯注射肺癌细胞组。
C.肺部转移组织HE染色,与单纯注射肺癌细胞组相比,发现联合BMSCs与肺癌细胞培养组的细胞密度更大。
D.检测联合BMSCs与肺癌细胞培养组与单纯注射肺癌细胞组,外泌体microRNAs的高表达/低表达情况。(动物层面)
E.分别进行BMSCs的常规及低氧条件下,培养3天,收集BMSCs分泌的外泌体进行分层聚类分析(Hierarchical clustering analysis),获得高表达/低表达的外泌体microRNAs
F.检测联合BMSCs常规培养及低氧条件下,外泌体microRNAs的高表达/低表达情况。(细胞层面)
G. D. F(细胞、动物层面)的韦恩图,获得共同高表达的248个外泌体miRNA。
H.qPCR验证韦恩图获得的外泌体miRNA表达情况,得到具有升高趋势且含有明显差异的外泌体:miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100。
Tips:作者如何从248个外泌体中,选择11个进行检测,这部分在正文及补充图中均未阐述。考虑可能时根据相关性评分,从上到下排序后进行的选择,但是,图中的检测顺序,是否按照相关性高低进行排序,并不知晓。

补充图1.分离鉴定外泌体
【小结1】
首先从动物层面进行联合培养外泌体培养, 围绕交互-表型进行相关论证,再到细胞层面的外泌体培养进行佐证,两者取交集,获得共同上调的外泌体miRNAs。

逻辑维度上:论证了BMSCs与肺癌细胞之间具有交互作用。

数据维度上,涉及到细胞、动物实验。

02

外泌体与表型的单变量论证

图2. 低氧状态下BMSCs分泌的外泌体可以通过EMT模式促进肺癌细胞的转移
A .B.Transwell检测,两株肺癌细胞的侵袭和迁移情况。发现缺氧状态下,外泌体可以导致LLC细胞的侵袭程度增加。

C.qPCR检测上皮-间质marker表达,发现低氧培养组的EMT marker均高于常规培养组。

D. E.动物实验,肺部转移情况进行验证。

补充图2. 补充论证低氧状态下BMSCs分泌的外泌体可以通过侵袭/迁移模式促进肺癌细胞的转移。EMT对侵袭/迁移的调控论证(缺失)
【小结2】
涉及到的表型:以EMT为主,还有嵌套的细胞侵袭和迁移表型。

论证形式上:采取多表型多实验论证、多株细胞系平行验证、细胞、动物。

03

主变量(外泌体miRs)的单变量论证


图3.BMSCs分泌miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100

A.Transwell检测miR-193a, miR-210-3p 和miR-5100的侵袭能力,发现通过过表达三个外泌体,能够获得最高的侵袭能力。(一正)

B.Transwell检测miR-193a, miR-210-3p 和 miR-5100的侵袭能力,发现通过抑制三个外泌体的表达,侵袭能力最低。(一反)

C.qPCR检测上皮-间质marker。发现,抑制外泌体的分泌后,EMT marker表达情况均下降。(沉默主变量观察表型)
补充3.对主变量单变量论证的形态学补充
图6. 外泌体miRNA癌症转移的标志物

A.临床样本检测。与正常人相比,miR-193a-3p ,miR-210-3p 和 miR-5100在癌症患者中高表达。

B.临床样本检测。与正常人、原位肺癌相比,miR-193a-3p ,miR-210-3p 和 miR-5100在肺癌转移的患者中高表达。

C.ROC曲线分析,与正常人相比,miR-193a-3p ,miR-210-3p 和 miR-5100在癌症患者中诊断效能大。

D.ROC曲线分析,与正常人、原位肺癌相比,miR-193a-3p ,miR-210-3p 和 miR-5100在肺癌转移的患者中诊断效能大。

补充图6.三个外泌体两两组合后,观察ROC曲线下面积,无高敏感性和特异性
【小结3】
主变量(外泌体)的单变量论证。包括一正一反,与EMT、迁移表型的调控性论证。

本部分单变量论证,验证维度有细胞,有动物,有临床样本。

04

观察外泌体的去路(进入受体细胞内)


 
图4.外泌体从供体细胞中来,进入受体细胞

A.免疫荧光染色,给受体细胞一个RFP红色荧光标记,使用PKH67检测外泌体表达。发现低氧组,外泌体表达量更多。(证明缺氧状态下受体细胞外泌体分泌增多)

B.qPCR检测受体细胞分泌的miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100的表达,发现受体细胞内外泌体增加。(证明缺氧导致受体细胞内外泌体分泌增多)

C.qPCR检测在外泌体抑制剂的作用下,受体细胞内miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100的表达被抑制。(证明阻断供体细胞分泌的外泌体,受体细胞内的外泌体含量降低)

D.流式技术分选带有RFP标记的受体细胞。发现RFP信号随着共培养时间的延长而增加。

E.qPCR检测共培养细胞和不含BMSC培养的肺癌细胞之间,miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100的表达。发现共培养细胞内,外泌体含量增加。(证明受体细胞本身不产生外泌体,但是共培养可以让受体细胞获得外泌体)
【知识点】
GW4869,可以抑制外泌体分泌
PKH67(外泌体绿色荧光标记染料)
RFP(红色荧光染料)
【拓展】【其他外泌体染料】外泌体红色荧光标记染料(PKH26)、外泌体荧光染料(DiR)

补充图4.供体细胞内外泌体的产生与释放
A.缺氧条件下,受体细胞的外泌体含量高。

B.BMSC细胞,在常氧状态下含量高,在缺氧状态下含量低。说明BMSC在常氧状态下,外泌体储存在胞内,当细胞发生缺氧时,胞内外泌体被释放出去。
【知识点】
U6 snRNA在做miRNA实时荧光定量PCR中充当内参
【小结4】
观察受体细胞摄入外泌体的情况。

(图1-4)在逻辑维度上论证:
【外泌体从哪儿来】
受体细胞不产生外泌体
供体细胞分泌的细胞微囊泡是外泌体
供体细胞在常氧状态下储存外泌体
供体细胞在缺氧状态下释放外泌体

【外泌体到哪儿去】
供体细胞分泌的外泌体可以被受体细胞摄取,共培养后,受体细胞外泌体增多
阻断供体细胞分泌的外泌体后,共培养后,受体细胞内的外泌体含量下降

05

受体细胞内机制探索【主变量上游的调控】


图5.BMSCs分泌的外泌体,通过效应变量STAT3,促进受体细胞的EMT转化

A.RNA-Seq检测,发现上调的基因在JAK-STAT通路富集。(细胞维度寻找效应变量)

B.WB检测STAT3, p-STAT3的蛋白表达。

C.Transwell检测细胞侵袭。发现抑制stat3,可以回复外泌体对侵袭的作用。(Rescue)

D.qPCR检测Snail 和 Vimentin的mRNA表达。发现抑制stat3,可以回复外泌体对EMT的作用。(Rescue)

E.WB检测Stat3的蛋白表达。发现抑制miR-193a-3p, miR-210-3p 和 miR-5100,可以回复由于缺氧释放的外泌体对p-STAT3表达增强的作用。

补充图5.BMSCs分泌的外泌体可以激活STAT3(动物维度-升维寻找效应变量)
【小结5】
逻辑维度上论证:
外泌体-效应变量二元论证
外泌体-效应变量调控必要性论证
外泌体-效应变量STAT3-表型(侵袭/EMT)调控必要性论证
【逻辑维度】
细胞交互论证【有现象、找变量、分离鉴定、观察摄入、调控论证、筛分子】

单变量论证【表达差异、一正一反、细胞、动物、临床样本】
调控性论证(细胞)
在供体细胞中阻断外泌体分泌
在受体细胞中阻断外泌体吸收(缺失)

二元变量论证
主变量调控效应变量的二元论证
主变量通过效应变量调控表型的调控必要性论证(Rescue)

间接作用机制
主变量调节表型,依赖效应变量发挥作用,另外,本文虽然整体论证比较简单,但是逻辑紧密,层层递进。分别围绕供体细胞,和受体细胞两个维度进行论证。

既证明正常情况下,BMSCs内出现外泌体,并且储存在胞质中,只有在【缺氧】状态下,外泌体才会从BMSCs中释放,又证明受体细胞内的外泌体是供体细胞提供的,单纯受体细胞是没有外泌体存在的。

正是由于外泌体的存在,才能促进受体细胞发现EMT。每个步骤抽丝剥茧,层层深入,逻辑套路值得借鉴。
【思维导图】

【数据维度】多株细胞、动物、生信、临床样本
【创新性】
miR-193a-3p 为关键词,有127篇
miR-210-3p 为关键词,有122篇
miR-5100为关键词,有18篇

BMSCs, miR-193a-3p为关键词,有4篇
BMSCs, miR-210-3p为关键词,有1篇
BMSCs, miR-5100为关键词,有1篇
BMSCs, Hypoxic为关键词,有205篇
BMSCs, Hypoxic, stat3为关键词,有5篇

外泌体承担创新性,创新性强;外泌体与表型的关系,创新性强;外泌体与效应变量的关系,创新性强。
【不足之处】
本文虽然有一个细胞交互的外壳,但是实际上,外泌体承担主变量,属于二元变量论证,缺乏变量交互作用的直接机制论证,包括转录因子结合位点预测,以及EMSA、luciferase论证。后续可以考虑深入进行机制的探索。

以上是本次分享的全部内容,如果有哪里不清楚或者有疏漏的地方,欢迎批评指正留言,互相进步。


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