流式细胞术中如何减少死细胞的比例?

流式样品细胞中一般都含有一定量的死细胞,通过一定的方法可以减少样品中死细胞的比例,但是完全去除样品中的死细胞几乎是不可能的。流式分析的目标是活细胞流式分选的对象更要求是活细胞,所以如果在流式分析时将死细胞当作活细胞来分析,会严重影响流式分析结果。
减少样品中死细胞比例的方法
一般流式分析者都希望样品中死细胞尽可能少,保证流式结果的准确性,而样品准备的过程会直接影响到样品中死细胞的比例,下面列举了在样品准备过程中需要注意的事项,以尽量减少死细胞的产生。
(1)如果是直接从实验动物中获取目标细胞进行流式分析,需尽量缩短从处死动物到获得可以上样分析的样品细胞的时间,尽可能地减少在样品准备过程中细胞的死亡。细胞离体后一般都会在一段时间后死亡,室温下,样品准备时间不应超过5h;4℃条件下,不应超过10h。如果短时间内无法处理已经从动物中获得的细胞,应将细胞置于4℃冰箱中;如果长时间无法处理,则应将细胞置于无菌培养板中,在孵箱中培养,保持样品细胞的活力。
(2)如果从脏器中通过研磨获得单细胞悬液,研磨时动作应轻柔,切不可强行研磨,否则得到的可能是细胞碎片而不是活细胞。研磨棒的头部最好是柔韧性较好的橡胶,以减轻机械研磨对细胞的损伤。
(3)配制PBS缓冲被时,应根据配方严格配制,尤其注意确保缓冲液的渗透压,同时还应注意缓冲液的pH
(4)在准备样品细胞的过程中,常需要离心样品细胞,离心速度的控制也是比较重要的。在能够完全离心得到目标细胞的前提下,应尽量降低离心速度、缩短离心时间,避免离心速度过高、离心时间过长对细胞的损伤,否则产生大量细胞碎片,甚至会导致细胞死亡。
(5)分选细胞时耗时较长,在样品制备中可以加入适量的培养基,使细胞从培养基中吸收营养物质,延长细胞存活时间;如果分选型流式细胞仪配备有温控系统(或者冷却系统),则可将整个样品分选过程和分选后的细胞都控制在4℃条件下,以提高细胞的活力,减少死细胞的产生。

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