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【生信文献200篇】05 空间转录组DNA测序

00 文章简介

英文标题：Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by opographic Single Cell Sequencing

中文标题：通过空间单细胞测序鉴定乳腺癌的多克隆侵袭

期刊：《Cell 》

影响因子：38.637    

发表时间：2018-01-04

研究领域：乳腺癌、空间转录组

DOI号：10.1016/j.cell.2017.12.007

01 文献概括

作者结合了laser-capture microdissection (LCM), laser catapulting, whole-genome amplification (WGA)，and single-cell DNA sequencing这4个技术，创造性的开发了Topographic Single Cell Sequencing (TSCS) 技术，测量单个肿瘤细胞的基因组拷贝数谱，同时保留其在组织切片中的空间背景。作者将该方法应用在10例同时具有DCIS和IDC区域的患者,包含了1,293个细胞。作者发现DCIS和IDC之间不仅有着直接的基因组谱系，并且在IDC中的亚克隆群体显示大多数突变和拷贝数畸变在入侵前就已经在管道内发生了。
作者认为得到的结果支持多克隆入侵模型，其中一个或多个克隆逃离导管并迁移到邻近组织中以建立侵袭性癌。

02 研究背景

乳腺导管原位癌(DCIS)是早期乳腺癌最常见的一种，只有很小(10%-30%)的病例可能进展为浸润性导管癌(IDC)。
细胞浸润两种模型：
① independent lineage model：细胞谱系并行进化，不存在任何基因组异常。原位和侵袭区域之间的分子标记不一致。
② evolutionary bottleneck model：导管和侵袭区域之间的一致性突变，以及在侵袭过程中选择的许多侵袭特异性突变和拷贝数畸变(CNAs)。
单细胞DNA测序方法可从单时间点样本中重建异质性肿瘤的进化线。但会失去了原有的空间信息，无法对肿瘤细胞进行原位或浸润性分类。
因此，作者提出地形单细胞测序(TSCS)，结合激光弹射和单细胞DNA测序来测量单个肿瘤细胞基因组拷贝数的方法，同时在组织切片中保存它们的空间信息。作者追踪了DCIS-IDC患者的10个肿瘤样本在侵袭期间的克隆进化过程。其结果支持了原位和侵袭性肿瘤细胞亚群之间的直接基因组谱系，并进一步表明大多数突变和CNAs在侵袭前在导管内进化。这些数据表明，多个克隆从导管中逃逸，并共同迁移到邻近组织，从而形成侵袭性癌。

     03 实验数据

主要实验

  • Frozen Tissue Section Staining 冷冻组织切片染色

  • Single Cell Isolation by Laser-Catapulting 激光弹射的单细胞分离

  • Single Cell Whole Genome Amplification 单细胞全基因组扩增

  • Single Cell Barcoded Library Construction 单细胞条形码库构造

  • Bulk Frozen Tissue Microdissection 大块冷冻组织显微解剖

  • Exome Library Construction and Sequencing 外显子组文库的构建和测序

统计分析

  • Single Cell Copy Number Calculations 单细胞拷贝数的计算

  • Identification of Subclones from CNA Data 从CNA数据识别亚克隆

  • Multi-dimensional-Scaling 分析

  • Calculation of the Subclonal Diversity Index 亚克隆多样性指数的计算

  • Spatial Image Data Processing 空间图像数据处理

  • Mapping Spatial Coordinates and Genomic Data 测绘空间坐标和基因组数据

  • Exome Data Processing and Analysis 外显子组数据处理和分析

  • Targeted Deep Sequencing of PCR Amplicons PCR扩增子的靶向深度测序

  • Detection of Rare Mutations in Amplicon Data 在扩增子数据中检测罕见突变

  • Saturation Analysis to Estimate Cell Numbers 饱和分析估计细胞数

数据：SRP116771

04 研究结果

1

Spatially Resolved Single-Cell DNA Sequencing

这种方法结合了激光捕获微解剖(LCM)、激光弹射、全基因组扩增(WGA)和单细胞DNA测序。

先对组织样品进行染色，这样可以区分细胞，然后利用LCM技术来挑选微小区域的细胞，再利用laser catapulting精准的挑选一个单细胞去建库测序，单细胞的DNA扩增采取的是DOP-PCR技术，最后进行数据分析，找CNV情况，跟原来的空间位置信息进行关联。

2

Cohort of Synchronous DCIS-IDC Patients

选择了10例冷冻肿瘤的DCIS-IDC患者数据。由6名三阴性(ER-、PR-、HER2-)和4名雌激素受体(ER)阳性乳腺癌患者组成。

  • 冷冻肿瘤样本是在任何治疗干预之前收集的。每个患者平均有129个单细胞被测序以量化全基因组拷贝数。

  • LCM被用于从原位和浸润区域分离数千个肿瘤细胞。

  • 在高覆盖深度平行排列匹配的正常乳腺组织(平均= 144.1X, SEM = 20.3)以识别和过滤种系变异。

3

Copy Number Evolution during Invasion in Patient 8

如上图所示，对8号病人，作者从4个病变区域进行采样，总共分析了85 in situ cells and 150 invasive cells。

  • 分析测序数据的CNV。使用1-dimensional clustering可以把这些细胞分成4组，其中一组是没有拷贝数变异的二倍体正常细胞。肿瘤细胞分成“A,” “B,” and “C” 这3个亚克隆。

  • 使用TimeScape可以分析这些细胞的进化情况。

使用multi-dimensional scaling (MDS)分析也得到同样的结果，分成4组，而且可以看到in situ cells 和invasive cells是无法被区分开来的。

可以看到3个克隆都起源于ducts，然后A克隆在invasive cells的比例远少于in situ cells ，它的侵袭能力不及B,C克隆。因为B,C克隆部分肿瘤细胞有着EGFR的扩展，这被认为是侵袭能力的象征。

4

Copy Number Evolution during Invasion in Patient 4

作者对来自两个肿瘤区域（R1和R2）的46个原位细胞和58个浸润细胞进行测序，研究了P4侵袭期间的拷贝数演变（图3）。

单细胞拷贝数分布的分层聚类确定了一个二倍体细胞亚群（N）和两个非整倍体肿瘤亚群（A和B）（图3A，上图）。
从主要亚群中推断出的克隆谱系确定了一个共同的祖先。这些数据表明基因组拷贝数进化发生在导管内，并引起两个主要的肿瘤亚群。
MDS图显示，每个克隆基因型均由原位肿瘤细胞和侵袭性肿瘤细胞组成，没有特定的基因型与任何一个区域相关(图3B)。

5

Copy Number Evolution during Invasion in the Patient Cohort

对10个病人综合起来总共测了 425 in situ and 503 invasive 和365 stromal diploid cells，对数据进行分析，以描述肿瘤浸润过程中的克隆亚结构和拷贝数演变(图4)。
对单细胞CNA谱的聚类显示，大多数患者拥有1-5个主要的肿瘤亚群，这些亚群既位于原位，也位于浸润区域(图4A)。但比较奇怪的是有4个病人都是单克隆，或者说仅仅是从单细胞DNA测序得到的拷贝数变异无法区分不同的克隆。

即使对于有着多克隆的那些病人来说，并不是所有的克隆在in situ 和 invasive 的比例都发生了变化，说明只有部分克隆是具有高侵袭能力的。

作者在6例多克隆DCIS患者中推断出克隆谱系，并用TimeScape绘制了图谱(图4D, S2, S3, S4和S5)。这些数据表明，在所有患者中，亚群具有共同的进化起源和共同的躯干CNAs，这表明肿瘤是由导管中的单个细胞进化而来的。
这些数据表明，基因组进化始于导管中的单个细胞，并产生一个或多个克隆亚群，迁移到邻近组织，形成浸润性肿瘤团块。

6

Mapping of Spatial Topography and Clonal Genotypes

作者构建了 tanglegrams （系统发育的简化工具），以了解克隆基因型在多克隆肿瘤中的分布及其空间组织。
从单细胞拷贝数分布计算遗传距离树，并以最小的重叠连接映射到空间树(x和y坐标)。

虽然所有的克隆都在原位和侵袭区域被检测到，但是特异性的亚克隆更多的局限于导管，而其他的更普遍的存在于侵袭区域，这表明它们可能具有更具有侵袭性或迁移性的表型。

7

Mapping of Spatial Topography and Clonal Genotypes

作者利用LCM对数千个肿瘤细胞进行了显微解剖，并对其进行了deep-exome sequencing，研究肿瘤侵袭过程中的突变演化(fig.6) 。
为了识别不一致的特定突变，作者使用非同义突变进行oncomaps(图6B)。大多数非同义突变(平均87.4%)，在乳腺导管和侵袭区是一致的，表明这些突变在侵袭前就在乳腺导管内获得。然而，4例患者(P3、P4、P7和P8)中有特异性突变(n=12)或侵袭性特异性突变(n= 11)，且在这些患者中没有复发(表S3)。

  • 此表列出了通过激光捕获显微解剖组织区域外显子组筛选鉴定出的侵袭特异性非同义突变。

为了确定侵袭特异性突变是在导管中获得还是在侵袭后获得，作者对局部特异性突变(图6C)和侵袭特异性突变(图6D)进行了高覆盖深度(平均= 453,446X)的靶向深度扩增子测序。同时，作者对匹配的正常乳腺组织进行了有针对性的深度扩增子测序，以建立位点特异性背景错误率，并使用deepSNV识别显著突变。

结果如下：扩增子数据显示，在高覆盖深度时，许多局部特异性突变在侵袭区出现的频率较低。

通过构建肿瘤纯度归一化线图，作者进一步研究了这些一致性突变是否显示了突变频率的较大变化(图7)。分析显示，5例患者侵袭期间突变频率仅有微小变化(图7a)，而其他5例患者至少有1例突变，突变频率有较大(>0.5)变化(图7B)。

为了推断入侵期间的克隆动态，作者使用PyClone 2和克隆性推断肿瘤使用系统发育(CITUP)聚类突变频率和估计克隆亚群纯度和拷贝数归一化(图7)。该分析在每个患者中确定了2-5个主要亚群，这比单细胞拷贝数分析检测到的亚群数量要高。通过单克隆细胞拷贝数分析发现的一些肿瘤(P2、P3、P7和P9)根据推测的突变簇显示2-5个亚群。

这些结果表明，在拷贝数进化之后，导管内有持续的突变性进化，导致进一步的亚克隆变异发生在侵袭邻近组织之前。

5.延伸板块

1.单细胞测序与空间单细胞测序(TSCS)

单细胞转录组技术：

https://mp.weixin.qq.com/s/a3y46NNNO-wardO3XWwh0w

TSCS：

  • 能提供了有关细胞位置的空间信息，能更准确地从空间上测量和描述单个肿瘤细胞的具体特征，具体流程见文献fig.1。

2. 侵袭模型

A) independent lineage model
　　支持该模型的认为原位肿瘤和侵袭肿瘤是平行进化并且在基因组的畸变上没有共通之处
B) evolutionary bottleneck model
　　支持该模型的认为有多个克隆在导管内进化，之后单个克隆逃脱基底膜并扩展形成侵袭性肿瘤块
C) muticlonal invasion
　　支持该模型的认为有多个克隆在导管内进化，之后有多个克隆逃脱基底膜并扩展形成侵袭性肿瘤块

3. 本文的创新与局限性(文献展望部分)：

作者创新性的提出了一种空间分辨的单细胞DNA测序方法，并发现了新的浸润模型：多克隆浸润模型。但本研究具有以下局限：
①数据小：仅10名患者，不能排除一些早期乳腺癌患者遵循替代进化模型的可能性，特别是在低级别肿瘤中。
②在每个病人的细胞数量有限，这可能导致取样偏差。因此，作者计算了后验饱和曲线。
③没有研究表观遗传修饰或基质细胞类型，它们也可能调节肿瘤细胞侵袭周围组织的能力。

4. PyClone 及TimeScape

PyClone的简介：

PyClone, 就是对存在异质性的肿瘤来说，多次不同部位取样，或者不同时间取样，那么虽然说是同一个肿瘤病人，他们不同的测序结果理论上不一致的， 那么pyclone就可以分析出来，同一个病人的不同测序数据里面共有哪些亚克隆。

使用方法：使用pyclone来推断肿瘤纯度及肿瘤内部亚克隆结构

Timescape 简介：

Timescape的使用：利用 Timescape 做肿瘤进化鱼图

5. 文献相关名词

  • Ductal Carcinoma in situ (DCIS) 原位导管瘤，是一种癌细胞局限于乳腺导管，并且不转移的早期乳腺癌。

    乳腺原位癌主要有两种类型：原位导管癌（DCIS）和原位小叶癌（LCIS）

  • Invasive ductal cancer (IDC) 浸润性导管瘤，指癌细胞从管道或小叶中破裂出来，可以扩散（转移）到身体的其他部位。

  • DCIS-IDC patients ：同时患有DCIS和IDC的乳腺癌患者，其发病区域有3种细胞：normal stromal cells, in situ ducts, invasive cells。

  • Topographic Single Cell Sequencing (TSCS) ：空间单细胞测序技术，该方法提供了有关细胞位置的空间信息，能更准确地从空间上测量和描述单个肿瘤细胞的具体特征。

  • the independent lineage model：独立谱系模型，组织中不同的起始细胞通过不同的细胞谱系产生原位和侵入性亚突变，这些细胞谱系平行进化，不存在任何基因组异常。通过靶向研究表明，原位与侵袭区域之间的分子标记不一致。

  • the evolutionary bottleneck model：进化瓶颈模型，在导管的原位细胞和邻近组织的侵袭性细胞之间存在直接的基因组谱系。在导管内进化出多个克隆体，然后一个克隆体脱离基底膜，膨胀形成侵袭性肿瘤团块。

  • laser-capture microdissection (LCM)：激光捕获显微切割，是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。

  • whole-genome amplification (WGA)

  • degenerative oligonucleotide PCR (DOP-PCR)：简并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的随机序列，可以随机的和基因组DNA结合，从而实现对全基因组的扩增。

  • single-nucleus sequencing (SNS)  单核测序

  • Shannon(clonal) diversity：一种描述多样性的方法；

  • OncoMap：一种肿瘤体细胞突变检测平台，可以看做是一个panel,针对已知的突变位点进行设计，和芯片类似。

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