【生信文献200篇】06 高通量药物筛选 + Rhabdoid tumors

0.文献信息

英文标题:High-Throughput Drug Screening Identifies Pazopanib and Clofilium Tosylate as Promising Treatments for Malignant Rhabdoid Tumors

中文标题:高通量药物筛选确定了帕唑帕尼和甲苯磺酸氯纤溶作为恶性横纹肌瘤的有前途的治疗方法

期刊:《Cell reports》

影响因子:8.109    发表时间:2017-11-14

研究领域:高通量药物筛选

DOI号:10.1016/j.celrep.2017.10.076

1.概述

横纹肌样肿瘤(RTS)是一种以SMARCB1失活为特征的侵袭性儿科肿瘤。确定两种依赖SMARCB1的RT靶向治疗:抑制PDGFR和FGFR2的pazopanib和诱导内质网应激的钾通道抑制剂对甲苯磺酸氯氟铵。联合使用这两种药物可以诱导细胞凋亡并减少PDX肿瘤的生长。

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  • 横纹肌瘤 Rhabdoid tumors (RTs) 是婴儿,儿童早期罕见的侵袭性癌症,其特征是SMARCB1双等位基因失活。预后不良,寻求新的治疗组合非常紧迫。其他人研究了诸如酪氨酸激酶抑制剂(TKi's)等目标药物对多种细胞系的作用,从而确定了一种化合物对RT细胞系的某些功效。

  • 重新利用药物是快速药物开发的宝贵途径,因为已知的毒理学和药理学降低了监管障碍和成本。通过药物重新定位为患者寻找相关的新疗法在儿科尤为重要,RTs可以很好地进行此类实验研究。识别有前途的抗癌疗法的一种方法是进行大规模药物筛选,从而盲目评估抗癌和非癌性药物的活性。通过筛选1,200个批准的药物库来选择性抑制SMARCB1缺陷细胞的结果。从而确定了一个抗心律不齐药(氯非铵甲苯磺酸盐[CFT])和广泛的TKI的如瓦他拉尼,普纳替尼,和帕唑帕尼,与最近的报道是一致的。我们发现,必须将几种酪氨酸激酶受体(RTK)一起靶向,以概括宽泛TKi的体外毒性。最后,我们证明了筛选中的两个药物CfT和pazopanib的结合会延迟体内肿瘤的生长,具有与目前临床中使用的常规化学疗法相当的功效。

2.实验方法

2.1 实验设计

细胞系

重点关注Rhabdoid tumors (RTs) ,所以挑选了两种细胞系:

  • SMARCB1-positive cell lines,包括 I2A 和 (I2A + SMARCB1)

  • SMARCB1-negative cell lines (G401 and G402)

有意思的是 pazopanib 这个药物在这两个细胞系表现有统计学显著的区别。

还引入了另外5个人类Rhabdoid tumors (RTs) 细胞系:

  • KD (Versteege et al., 1998)

  • 2004 (Versteege et al., 1998)

  • DEV (Giraudon et al., 1993)

  • Wa2 (Handgretinger et al., 1990)

  • LM (Versteege et al., 1998).

还有4个细胞系作为对照:

  • A673 (Ewing sarcoma)

  • DAOY (medulloblastoma)

  • A549 (SMARCA4-deficient lung carcinoma; obtained from the ATCC [CRL-1598, HTB-186, and CCL-185, respectively])

  • SK-N-BE(2)C (neuroblastoma) (Barnes et al., 1981).

药物筛选背景知识

重点挑选那些能显著抑制SMARCB1缺陷型细胞系生长的药物。

计算了药物的 robust Z [RZ] score 来作为评价标准。(初筛)

总共挑选了10个药物

  • compounds showing a RZ score <−5 in at least one RT cell line (I2A or G401 cells) and showing no activity in I2A+ cells (RZ score >−2), which comprised 5 drugs (5-fluorouracil, luteolin, rimexolone, amethopterin [R,S], and methotrexate);

  • (2) compounds with some weak activity in I2A+ cells (−5 < RZ score <−2) and showing a strong effect in at least one RT cell line (RZ score <−10) and a differential between I2A+ and I2A exceeding 2, leading to the selection of an additional 5 compounds (CfT, podophyllotoxin, ciclopirox ethanolamine, thioguanosine, and vatalanib).

又测了48小时的药物处理IC50 (μM)

只有6个药物满足在两个SMARCB1缺陷型细胞系都表现 (IC50) <10 μM ,其中四个都是anti-mitotic类别的,所以抛弃。

最后剩下两个药物:

  • one antiarrhythmic agent (clofilium tosylate [CfT])

  • broad TKi’s such as vatalanib, ponatinib, and pazopanib

其中CfT是potassium channel 的抑制剂

对于TKi’s药物,挑选了9个FDA批准的药物比较发现pazopanib最显著,后面的研究就替换掉了 vatalanib。

药物机制研究

TKi’s药物就是作用于 tyrosine kinase receptors (RTKs) ,2个在药物pazopanib处理前后有区别:

  • platelet-derived growth factor receptors(PDGFRs) :

  • fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)

还有Pazopanib和CfT的联合用药的体外细胞系实验。

PDX模型验证

制作了两个PDX模型:

  • RT-001-HAM (liver tumor; Nicolle et al., 2016)

  • IC-pPDX-6 (soft tissue; Curie Institute).

pazopanib showed actual growth delay on two extra-cranial RT PDXs as a single agent.

2.2 实验数据

表达芯片及RNA-Seq数据

在两个细胞系 (DEV and G401 ) 处理CfT 前后测转录组表达数据,共4*3=12个样本。

在I2A SMARCB1-def细胞系添加SMARCB1处理的时间序列,共(0,2,4,7,14day)*3=15个样本。

数据公布在GEO: GSE98277 : GSE102467

  • I2A microarray gene expression data

  • CfT-treated G401 and DEV RNA-seq data

3.实验结果

1

High-Throughput Screening of US Food and Drug Administration-Approved Drugs Identified Vatalanib and CfT

在存在或不存在强力霉素的情况下(I2A + SMARCB1,以下称为I2A +)在G401 细胞系和I2A诱导型细胞系中筛选了Prestwick化学文库,其中包含1200个批准的分子,以鉴定药物特定于SMARCB1缺陷细胞。G401,I2A和I2A +细胞中细胞毒性药物的百分比(robust Z [RZ] score < -2)分别为14%,21%和17%(图1A)

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根据上面的公式来计算百分比
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我们最终选择了(1)在至少一种RT细胞系(I2A或G401细胞)中RZ得分<-5且在I2A +细胞中无活性(RZ得分> -2)的化合物,其中包含5种药物(5-fluorouracil, luteolin, rimexolone, amethopterin [R,S], and methotrexate)(2)在I2A +细胞中活性弱的化合物(-5 <RZ得分<−2)并且在至少一种RT细胞系中表现出强效的作用(RZ得分<-10),并且I2A +和I2A之间的差异超过2 ,从而选择了另外5种化合物(CfT,鬼臼毒素,环吡酮乙醇胺,硫鸟嘌呤 ,以及vatalanib)。最后鉴定了10种化合物对I2A和/或G401活性的抑制作用明显强于I2A+(如下表)
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2

Confirmation of the Candidate Drugs

6种化合物在两种SMARCB1缺陷细胞系中的半数最大抑制浓度(IC50) <10 μM ,抗有丝分裂药物(氨甲蝶呤[R,S]、甲氨蝶呤、鬼臼毒素和硫鸟苷);抗心律失常药物(CfT)和TKI(Vatalanib)。不考虑抗有丝分裂药物
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剩下的两个化合物Vatalanib 和 CfT在7个SMARCB1阴性的RT细胞系上进行了测试,并与5个SMARCB1阳性的细胞株(I2a+,慢周期,在2个条件下和4个快速周期的非RT细胞)进行了比较。在体外,vatalanib或CfT可抑制SMARCB1阴性细胞的生长(IC50中位数分别为5.1 mm和4.2 mm),而SMARCB1阳性细胞株受到的影响明显较小(IC50中位数分别为10.8 mm和15.5 mm)

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3

Human RT Cell Lines Are Specifically Sensitive to Pazopanib

Pazopanib对SMARCB1阴性和SMARCB1阳性细胞株的作用差异最大(p=0.001),提示TKi对该药物的SMARCB1依赖作用最强

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4

Phosphoproteomic Screen Identifies PDGFRa/b and FGFR2 as Targets of Pazopanib in RTs

为了确定pazopanib靶向的RTK,我们使用Proteome Profiler人磷酸化RTK阵列评估了49个RTK在处理I2a、DEV、G401和KD细胞系时的磷酸化情况。在被pazopanib抑制的所有RTK中(图S2),只有两种受体在四种细胞系中受到影响:(1)血小板衍生生长因子受体(PDGFRs;在I2a和DEV中的PDGFRA和在G401和KD中的PDGFRb),我们在DMSO处理的细胞中检测到了最强的信号。(2)成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2),尽管其强度低于PDGFRs(图2A和S2)

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为了验证PDGFR和FGFR2的活性以及对Pazopanib的敏感性,我们将I2a、DEV、G401和KD细胞置于碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)或血小板衍生生长因子(PDGF)刺激下,无论是单独还是在帕佐帕尼处理的情况下。Pzopanib能有效抑制I2a和DEV细胞PDGFRA和G401和KD细胞PDGFRb的PDGF活化(图2B)。下游效应分子ERK1/2和AKT也可被PDGF激活,被pazopanib抑制,但对KD细胞的作用较弱。激活ERK1/2的bFGF信号也观察到了类似的结果。

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5

PDGFRs and FGFR2 Are Expressed in Primary RTs and Dependent upon SMARCB1 Loss

我们分析了PDGFR和FGFR是否是人类进一步研究的相关靶标。根据pazopanib在多个细胞系中抑制其磷酸化的RTK(图S2),根据其在原发肿瘤中的表达水平进行排序;PDGFRα,FGFR2和PDGFRβ是最高表达的RTK(图2C)。然后,我们使用I2A诱导型细胞分析了SMARCB1如何影响RTK和下游效应子的表达。RTK的无表达水平时改变SMARCB1再表达,除了PDGFRα和FGFR2(图2D)

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下游抑制剂DUSP1,DUSP9和SPRY2发生了显著变化(图S3 A)因此,PDGFR和FGFR2,Pazopanib在我们细胞系中的两个共有信号转导靶标,是原发性肿瘤中表达最强的RTK,它们的表达以及各种信号转导因子均受SMARCB1调控。

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对人类样品中公开数据的分析显示,PDGFRα和FGFR2启动子的甲基化程度极低(图S3B–S3D)。相反,G401细胞系中的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据显示SMARCB1重新表达后增强子区域中没有组蛋白修饰(图 S3E和S3F)。这些发现表明SMARCB1通过启动子甲基化调节RTK表达。

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6

Dual Depletion of PDGFR and FGFR2 Partly Recapitulates the Effect of Pazopanib on RT Cell Lines

为了证实SMARCB1缺陷型细胞对FGFR2和/或PDGFRα/β抑制的敏感性,我们研究了PDGFRs或FGFR2的耗竭是否可以重现Pazopanib的作用。为了这个目的,用针对FGFR2和/或PDGFRα(I2A和DEV)和FGFR2和/或PDGFRβ(G401和KD)的小干扰RNA(siRNA)转染I2A,DEV,G401和KD细胞。

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尽管siRNA具有很强的抑制作用(图2E),但PDGFR和FGFR2的消耗并没有影响RT 细胞的活力(图2F)或凋亡(图2G)。相反,在I2A和DEV细胞中共消耗PDGFRα和FGFR2,在G401和KD细胞中共消耗PDGFRβ和FGFR2会在所有四个RT细胞系中显著降低细胞活力,但在对照I2A +细胞中则不会(图2F)。在I2A,G401和KD细胞中,与对照细胞相比,双重耗竭也诱导了细胞凋亡的显著增加(图2G),这与AKT磷酸化降低有关。因此,仅PDGFR或FGFR2的消耗不足以表观Pazopanib的作用,后者通过双重RTK失活可更好地概括。

7

Combinatory Treatment of Pazopanib and CfT Induces Apoptosis in RTs

我们分析了PDGFR和FGFR是否是人类进一步研究的相关靶标。根据pazopanib在多个细胞系中抑制其磷酸化的RTK(图S2),根据其在原发肿瘤中的表达水平进行排序;PDGFRα,FGFR2和PDGFRβ是最高表达的RTK(图2C)。然后,我们使用I2A诱导型细胞分析了SMARCB1如何影响RTK和下游效应子的表达。RTK的无表达水平时改变SMARCB1再表达,除了PDGFRα和FGFR2(图2D)
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但是,RNA测序CfT处理后在DEV和G401细胞上进行的RNA测序显示蛋白质代谢和内质网应激发生显着变化(图S4),这表明TKi和CfT通过两种互补机制诱导凋亡。
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(A)I2a、DEV、G401和KD细胞系在隔夜饥饿、bFGF或PDGF-BB刺激和CFT处理后,PDGFRA、PDGFRb、ERK1/2和AKT磷酸化水平的免疫印迹。
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(B)显示DMSO或CFT处理48小时内DEV(左图)和G401(右图)基因差异表达的火山图。红色水平线对应p值=0.05,蓝色垂直线对应log2折叠变化>1(折叠变化>2或<0.5)的绝对值。与二甲基亚砜(DMSO)处理相比,CFT增加了火山图右侧绘制的基因。
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(C)在DEV(上图)和G401(下图)中,通过比较CFT和DMSO条件获得的基因集富集图。
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(D-E)对两种处理条件之间折叠变化>2(D)或1.5(E)的重叠基因以及G401和DEV实验中重叠的基因进行基因本体论分析(如Venn图所示)

8

Pazopanib Alone or In Combination with CfT Reduces RT Growth In Vivo

为了评估pazopanib和CfT对体内RT的治疗潜力,我们使用了两种RT患者来源的异种移植(PDX),RT-001-HAM(外显子1-4,纯合子缺失)和IC-pPDX-6(外显子1-9,纯合子缺失)。在这两种PDX中,与赋形剂治疗的小鼠相比,pazopanib治疗显著降低了RT增长。与CfT联合应用显示pazopanib的抗肿瘤作用显著增强。联合用药对这两种PDX的疗效与标准常规化疗(依托泊苷和卡铂)相似,甚至更强(图3B-3E)。

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我们的候选药物单独和联合使用显著降低了Ki67染色(图3F和3G)。

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总之,这些结果证明了pazopanib的治疗潜力,并进一步证明了pazopanib与CfT联合治疗RTS的益处。

4.延伸版块

1.酪氨酸激酶的作用方式和受体酪氨酸激酶抑制剂

蛋白酪氨酸激酶按其结构可分为受体酪氨酸激酶(RPTK)和非受体酪氨酸激酶(NRPTK)。许多RPTK都与肿瘤的形成有关,其原因包括基因突变、染色体易位或简单的激酶过表达。

受体酪氨酸激酶(RTKs)功能

细胞信号转导通路通过细胞表面受体将外部信号转化为内部信号,细胞膜受体通常有两种转化途径:通过与G蛋白偶联方式,或通过与酶受体结合。两种方式均可将信号转换、转移或放大。受体酪氨酸激酶便是通过G蛋白偶联的方式,将膜受体信号向下游转导,蛋白激酶是一种磷酸转移酶,其作用是将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上,使蛋白质磷酸化,是膜受体信号的转换部。现已知六类酶偶联型受体:受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体酪氨酸磷脂酶、与酪氨酸激酶连接的受体、  受体鸟苷酸环化酶和组氨酸激酶连接的受体。酶偶联受体转导的信号通常与细胞的生长、增殖、分化、生存有关。受体酪氨酸激酶,覆盖的基因多种与肿瘤发生、发展密切相关,部分基因发生突变而导致信号通路的异常,异常活化的信号通路促进肿瘤生长、增殖并维持肿瘤恶性特征。
常见的受体酪氨酸激酶结构包括胞外结构域(与配体结合部分)、单次跨膜的疏水α螺旋区和胞内结构域(胞内结构域含有RTK活性)。小分子酪氨酸激酶抑制剂的作用部位为胞内结构域。

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酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)的作用

  • 为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物

  • 由于酪氨酸激酶在细胞内担任许多讯号传递的开关,因此该酶的突变常常引起癌症;酪氨酸激酶抑制剂因此通常做为癌症药物使用。

  • 酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷(ATP)与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂

  • 酪氨酸激酶抑制剂的作用机制即抑制蛋白质酪氨酸残基磷酸化,从而阻断下游信号通路的传导,抑制表达位置的肿瘤细胞的生长转移等

2.vatalanib or CfT 的体外治疗抑制SMARCB1阴性细胞生长,而SMARCB1

阳性细胞系受到的影响则较小?

找着找着发现找到的药物vatalanib有缺陷,IC50太高,还能找同类型的药物?应该也是吧,结构差不多,药理作用接近。Pazopanib发现SMARCB1阴性和SMARCB1阳性细胞系之间的最高差异(p = 0.001),表明该药物对TKi的SMARCB1依赖性作用最大。

SMARCB1

概述

SMARCB1是位于染色体22q11.2上的基因SMARCB1的蛋白产物。广泛表达于正常细胞的细胞核,一些肿瘤可表达缺失。血管内皮和淋巴细胞核着色可作为内对照。

信号定位

细胞核

在肿瘤中的表达情况

  • 几乎全部阳性(≥95%的病例阳性):食管未分化癌

  • 经常阳性(<75%,≥55%的病例阳性):肌上皮瘤

  • 几乎全部阴性(<5%的病例阳性):肾髓质瘤,横纹肌样瘤

3. 磷酸化蛋白质组学筛查确定 PDGFRα/β 和 FGFR2 为RT中帕唑帕尼的

靶标?磷酸化蛋白质组学是什么流程?

蛋白质翻译后修饰 (post-translational modification,PTM)可以改变蛋白质结构和活性、 介导细胞信号转导,细胞对外界环境刺激的响应往往通过PTM 实现。PTM 类型众多,包括磷酸化、乙酰化、泛素化和糖基化。磷酸化修饰是一 种可逆的蛋白质修饰,通过磷酸化修饰的变化,可以调控蛋白质活性、影响信号传递过程。磷酸化修饰是细胞健康和疾病的核心调控机制之一,依靠众多种类激酶和磷酸酶,细胞可以迅速地增加或减少蛋白质的磷酸化修饰,实现复杂而精确地调控。真核生物中,约有 1/3 的蛋白质具有磷酸化修饰,这也体现了磷酸化修饰的普遍性和重要性。
蛋白质磷酸化是一种非常重要且广泛存在于原核生物和真核生物中的翻译后修饰调控方式,参与细胞的增殖、发育、分化、凋亡,细胞骨架调控、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等,对许多生物的细胞功能起着生物“开/关”作用。研究磷酸化蛋白质组,解析生命体复杂多样的生理和病理过程。

基本原理

蛋白质发生磷酸化修饰后,其分子质量会发生相应的改变,通过质谱能够精确测定蛋白质或多肽的分子质量。另一方面,通常情况下发生翻译后,修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广,因而在质谱检测前需要对发生修饰的蛋白或肽段进行富集。常用的磷酸化蛋白质富集方法为TiO2或IMAC法。磷酸化肽富集完成后,进行质谱检测,可实现对磷酸化蛋白质大规模定性定量分析。

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  • 磷酸化蛋白质组学研究流程

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技术优势

  • 全面性:以整个细胞所有蛋白为研究对象,囊括了细胞内所有具有生命功能的蛋白

  • 可靠性:可一次性全面检测不同蛋白激酶及磷酸化酶对同一个蛋白磷酸化程度的影响,因而结果更加普遍性和可靠性

  • 高效性:磷酸化蛋白质组学反映的是细胞内真实发生的事件,考虑了各种变量,克服了经典生物学中逐步添加变量的缺陷,更为高效

  • 探索性:磷酸化蛋白质组学以细胞内全部蛋白质为研究对象,相对于传统的生物学研究以及蛋白质芯片,更易发现未知的新磷酸化位点和磷酸化蛋白质

分析内容

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4.Compound Screening workflow

筛选实验的化合物筛选流程,G401和I2a细胞,在存在或不存在多西环素的情况下,(每孔3×10~3个细胞)种植在胶原涂层的黑色透明底板上,涂有组织胶原,在40µL培养基中在37°C,5%CO2下培养。二十四个小时后,来自384孔源板的1,200种FDA批准的药物在细胞培养基中被稀释到2 mM的浓度。为了研究药物对设计细胞的影响,将10µL含化合物的生长培养基自动转移到含有设计细胞的平板上(10µM最终药物浓度加0.5%二甲基亚砜)。载体对照孔只接受不含药物的培养基(0.5%DMSO),并放置在每个分析板的前两柱和最后一柱。在每个盘中,包括紫杉醇处理过的井(400 Pm),并且仅用作配药的技术控制。加入药物后,37°C孵育48h,然后用PBS冲洗2次,然后用10%福尔马林溶液固定15min。加入含Triton-X-100的DAPI溶液(终浓度:DAPI0.2μg/mL,Triton-X-100 0.2%(v/v)),一步渗透并染色。细胞孵育30 min后,去除染色,每孔加入50 μL PBS。除固定和细胞染色步骤需要Titertek MAP-C2液体处理器外,所有液体分配步骤均使用Freedom Evo96R 150 TE-MO(TECAN)进行。对于每个被测试的细胞系,实验在两个独立的实验中重复进行。使用IN Cell Analyzer 2000自动广域系统(GE Healthcare)在10倍放大(Nikon 10X/0.45,Plan Apo,CFI/60)下使用4个随机选择的具有适当滤光片设置和曝光时间的图像场自动成像。使用IN Cell Analyzer Workstation 3.7软件中实施的多目标应用模块自动计算细胞核计数。

5.甲基化数据处理

‍从GSE70678下载来自150个AT/RT原发肿瘤的甲基化阵列数据分析DNA甲基化阵列IDAT文件。使用RnBeads BioConductor R包处理数据。使用“Illumina”方法和“Methylumi.noob”背景校正对探针强度进行归一化。CpG上下文之外的、针对X和Y染色体或包含单核苷酸多态性的探针被移除。BioConductor R包用于可视化特定位点的每个CpG位点的甲基化水平。β值度量被选择来评估给定CpG位点的甲基化水平。β值是来自甲基化探针的信号相对于甲基化探针和未甲基化探针的比率。它的值范围从0到1,分别表示询问的CpG位点的完全去甲基化和完全甲基化。给定启动子的甲基化水平被计算为包括在该启动子位点中的所有CpG位点的β值的平均值。类似地,给定CpG岛的甲基化水平被计算为包括在该CpG岛上的所有CpG位点的β值的平均值。我们将启动子区域定义为转录起始点(TSS)上游至TSS下游500bp的区域。TSS站点对应于hg19 Ensembl注释。使用RnBeads包中包含的注释表对CPG岛进行注解,该注释表对应于UCSC基因组浏览器中提供的注解。与CpG岛长度至少25%重叠的启动子称为CpG岛启动子。所有其他不符合这一标准的启动子都被认为是非CpG岛启动子。CpG岛对应于UCSC基因组浏览器跟踪中用于hg19基因组构建的CpG岛注释。运行Bedtools版本2.25.0的intersectBed命令使启动子和CpG岛位点相交。

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