Mol Cancer 最新进展:蔡秀军教授团队揭示 m6A 修饰的环状 RNA 介导肝癌耐药新机制

肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,而作为肝癌大国,有超过 50% 的新发肝癌发生在我国。索拉非尼是首个 FDA 批准的用于晚期肝细胞癌靶向治疗的药物。但由于肝癌的发生发展机制复杂且异质性大,在接受索拉非尼治疗 6 个月后,大多数患者会对索拉非尼产生耐药性,使得疾病进一步恶化,给治疗带来了巨大的困难

来自浙江大学医学院附属邵逸夫医院的蔡秀军教授团队,致力于肝癌的临床与基础转化研究,近日在肝癌靶向治疗耐药领域获突破性进展。研究团队阐述了 circRNA-SORE (a circular RNA upregulated in sorafenib-resistant HCC cells)介导索拉非尼耐药的机制,同时发现了调控 circRNA-SORE 表达水平的表观遗传学机制

该研究以题为 N6-methyladenosine-modified circRNA-SORE sustains sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by regulating β-catenin signaling 的文章,刊登在 BMC 出版集团旗下的肿瘤学权威学术期刊 Molecular Cancer(IF=15.302)上。

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图 1. 机制展示

研究数据表明,circRNA-SORE 可作为 ceRNA(竞争性内源性 RNA)通过吸附 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p,从而竞争性激活 Wnt /β-catenin 途径来诱导索拉非尼耐药

更重要的是,团队发现 circRNA-SORE 中特定腺苷的 N6 - 甲基腺苷(m6A)水平升高有助于维持其 RNA 的稳定性,继而使 circRNA-SORE 的含量升高,促进了耐药的产生。

本研究在国际上首次提出 circRNA 上特定位点的 m6A 修饰可通过 RNA 稳定性影响其表达水平,是对肝癌表观遗传学分子机制的创新性探索,阐述了肝癌靶向治疗耐药性产生的新机制,为寻找晚期肝癌病人新型治疗靶点提供新的线索。

 

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图 2. circRNA-SORE 在索拉非尼耐药的肝细胞肝癌中明显升高,并且在耐药性的维持中发挥重要意义

研究团队首先在前期的研究中建立了索拉非尼耐药的肝癌细胞系,并找到了在耐药形成过程中扮演重要角色的 circRNA-SORE。与预期相符的是,circRNA-SORE 在索拉非尼耐药的细胞和动物肿瘤中,表达均明显上升,且对于维持索拉非尼耐药性至关重要。在耐药细胞中,沉默 circRNA-SORE 使得细胞增殖明显减少、凋亡显著增多且克隆形成能力明显下降。研究团队认为,沉默 circRNA-SORE 主要通过诱导了肿瘤耐药细胞的凋亡,提高了索拉非尼的疗效。

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图 3. circRNA-SORE 作为 ceRNA 吸附 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p,

竞争性激活 wnt /β-catenin 途径诱导索拉非尼耐药

CircRNA 最常见的作用机制是作为 ceRNA,吸附各种各样的 miRNA,导致原本与 miRNA 结合的 mRNA 的翻译不能被 miRNA 阻止,形成了 mRNA 的竞争性激活,从而引起下游蛋白表达水平的升高而产生相应的生理病理表现。

那么 circRNA-SORE 是否也具有 miRNA 海绵的特性呢?

首先,研究团队通过基于 TargetScan & miRanda 的 miRNA 结合预测软件,获得了 12 个预测与 circRNA-SORE 结合的 miRNA,并针对 circRNA-SORE 进行 RNA-pulldown 实验分析验证,发现有 8 个 miRNA 在 circRNA-SORE 上有明显的富集,证明 circRNA-SORE 确实可以扮演了 ceRNA 的角色。

进一步功能实验表明,过表达 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 的 mimics 后,耐药细胞对索拉非尼的敏感性显著提升。为了探究 circRNA-SORE 调控 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 的具体机制,研究团队首先应用荧光原位杂交技术发现 circRNA-SORE 与 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 在细胞中存在着共定位,符合两者结合的特征。

RNA 免疫共沉淀显示进一步提示 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 可与 circRNA-SORE 相结合。circRNA-SORE 与 Ago2 的结合在耐药株中更容易被检测到,进一步提示了 circRNA-SORE 作为 ceRNA 功能的特性。针对 circRNA-SORE 上特定位点突变的双荧光素酶报告试验进一步提示了 circRNA-SORE 与 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 的结合

circRNA-SORE 结合 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 后又是如何调控索拉非尼耐药的表型呢

在肝癌中,wnt /β-catenin 通路起到十分关键的作用,而研究团队发现,耐药细胞中 β-catenin 的蛋白水平明显高于野生细胞,且其表达量与 circRNA-SORE 的表达水平呈正相关。进一步实验证明,耐药细胞中的 β-catenin 及其上游 wnt2b 的蛋白水平均受到 circRNA-SORE 以及 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 的调控,并且相应的表型实验结果均与调控方向相符,说明 circRNA-SORE 调控的这两个 miRNA 的下游很有可能就是 wnt/β-catenin 信号通路。

基于这个假设,研究团队针对 wnt2b 的 mRNA 与 miR-103a-2-5p 及 miR-660-3p 的结合位点预测,并进行位点突变前后的双荧光素酶报告实验。系列结果显示,miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p 可与 wnt2b 的 mRNA 3‘UTR 区结合,促进了 mRNA 的降解,从而抑制了 wnt2b/β-catenin 信号通路。

至此,研究团队通过实验证明了 circRNA-SORE 以 ceRNA 的角色吸附隔离 miR-103a-2-5p 和 miR-660-3p,竞争性激活了 wnt /β-catenin 信号通路,诱导并维持了肝癌对索拉非尼的耐药

 

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图 4. CircRNA-SORE 与 m6A 的关系,以及 circRNA-SORE 在动物模型中扮演的角色

在非编码 RNA 的研究中,引起 RNA 表达异常的原因始终是困扰众多研究者的问题之一

m6A 是 RNA 修饰中最为丰富的一种,研究者不断地发现 RNA 的 m6A 修饰在肿瘤的进展中扮演重要功能,而近年来研究者发现,circRNA 的 m6A 修饰(常发生在 RRm6ACH 模体上,R = G or A; H = A, C or U)可对其功能产生调控作用。

circRNA-SORE 上是否存在 m6A 修饰?m6A 修饰在其中会扮演什么样的角色?

带着前沿问题,研究团队首先通过 SRAMP 和 RMBase v2.0 数据库预测发现位于 circRNA-SORE 序列 juction 位点附近存在一个极有可能被 m6A 修饰的位点。RNA Pull-down 试验表明,circRNA-SORE 可与 YTHDF1、YTHDF2、METTL3 和 FTO 这些 m6A 相关的酶蛋白来相结合,提示 circRNA-SORE 可能被 m6A 调控

甲基化 RNA 免疫共沉淀 (methylated RNA Immunoprecipitation,meRIP) 实验表明,耐药细胞中 circRNA-SORE 的 m6A 修饰水平较野生细胞增高。研究团队进而对 m6A 修饰相关蛋白进行沉默发现,敲减 METTL3 和 METTL14 后,circRNA-SORE 的 m6A 修饰水平显著下降,而敲减 FTO 后,其修饰水平显著升高,提示了 circRNA-SORE 上 m6A 修饰位点的存在

一系列实验表明,circRNA-SORE 不仅被 m6A 修饰,其表达水平也受到 m6A 修饰水平的调控。然而,目前仍不确定的是,这种调控作用是在整体 m6A 水平上,还是特定位点的 m6A 水平上?

为了回答这一问题,研究团队进行了进一步探究,设计了一套针对 circRNA-SORE 中 m6A 位点的序列特异性吗啉代反义寡核苷酸(MAO)。与对照 MAO(MAO-NC)处理的细胞相比,在用 MAO 靶向 circRNA-SORE(MAO-SORE)处理的 HepG2-SR 细胞中,m6A 水平显着降低。

更令人兴奋的是,研究团队采用了最新的 CRISPR-Cas9-ALKBH5 复合物对 m6A 位点进行定点去甲基化技术,进一步证实了 circRNA-SORE 上存在预测的 m6A 位点,而将 m6A 位点突变的后,circRNA-SORE 的 m6A 修饰水平明显降低。

相关研究表明,m6A 修饰涉及转录后 RNA 代谢的所有方面,包括 mRNA 定位,剪接,翻译和降解,进而调节重要的生物学过程。研究团队发现,沉默腺苷甲基转移酶 METTL3 / 14 可降低 circRNA-SORE 的水平。值得注意的是,MAO-SORE 可以降低耐药细胞中的 circRNA-SORE 水平,但不能降低野生细胞中的 circRNA-SORE 水平,进一步提示 m6A 修饰可能促进 circRNA-SORE 在耐药细胞中的上调。

有趣的是,应用放线菌素 D 的 RNA 稳定性试验表明,在耐药细胞中,MAO-SORE 降低了 circRNA-SORE 的稳定性,同时野生型 circRNA-SORE 比 m6A 位点突变的 circRNA-SORE 更稳定。这些结果表明,m6A 修饰可能通过增加 circRNA-SORE 的稳定性来调节其表达

最后,研究团队利用构建的 CDX 小鼠肝癌成瘤模型及其对应的索拉非尼耐药模型,在体内水平证实了 circRNA-SORE 可以通过 wnt /β-catenin 途径来诱导索拉非尼耐药

 

综上,研究团队发现 circRNA-SORE 在索拉非尼耐药形成过程中发挥了重要的作用。本研究设计严谨、思路新颖,为肝细胞肝癌的临床诊疗提供了新的思路。

蔡秀军教授是论文的通讯作者徐俊杰博士后为论文的第一作者。该项研究受到国家重大科研项目、国家自然科学基金项目、浙江省重点研发计划、中国博士后科学基金项目、浙江省自然科学基金等资助。

通讯作者:蔡秀军教授

主任医师、博士生导师、FACS、FRCS

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教师个人主页:

https://person.zju.edu.cn/0094417

第一作者:徐俊杰博士

博士后、主治医师,硕士生导师

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教师个人主页:

https://person.zju.edu.cn/3318002

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参考文献:

Xu, J., Wan, Z., Tang, M. et al. N6-methyladenosine-modified CircRNA-SORE sustains sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by regulating β-catenin signaling. Mol Cancer 19, 163 (2020). https://doi.org/10.1186/s12943-020-01281-8

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