Nature Chemical Biology | 共价抑制NSD1组蛋白甲基转移酶

作者:石诚

来源:大科研小分享(Ai_Fen_Xiang2020)

背景介绍
大家好!今天给大家分享的是Nature Chemical Biology于8月31日发表的一篇文章。这篇文章是密西根大学以及哥伦比亚大学共同合作发表的一篇文章,主要介绍的是利用基于片段的药物设计方法发现NSD1组蛋白甲基转移酶抑制剂。
Nature Chemical Biology | 共价抑制NSD1组蛋白甲基转移酶
NSD甲基转移酶家族由三个成员组成-NSD1,NSD2(MMSET / WHSC1)和NSD3(WHSC1L1),它们调节染色质的完整性和基因表达。  当NSD的过度表达,突变和易位会显著的影响几种人类恶性肿瘤。其中NSD1的表达增强主要与肺癌、前列腺癌头颈部鳞状细胞癌有关。
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NSD1最具代表性的致癌作用与它与核孔蛋白98和96前体(NUP98)基因的易位有关。NUP98-NSD1作为一个有效的癌基因,其致癌活性取决于NSD1组蛋白甲基转移酶(HMT)的催化活性。这使得其成为开发小分子抑制剂的有吸引力的靶标。
所有NSD HMT均包含一个保守的催化SET结构域,该结构域具有一个独特的自抑制环,可阻止化合物靠近底物的结合位点。  因此设计靶向NSD SET结构域的小分子抑制剂十分困难。
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在这项研究中,作者采用了片段筛选策略,鉴定一系列与NSD1 SET结构域结合的小分子。并通过化学优化,开发了基于NSD1的共价抑制剂
实验结果
以下是BT5的整个发现过程:
为了鉴定NSD1 SET结构域的抑制剂,作者使用核磁共振(NMR)筛选了一个包含1,600个片段的化合物库,发现6-氯-1,3-苯并噻唑-2-胺(BT1)可以与SET域结合。 
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然后作者随后合成了BT1的几种类似物,发现引入4-羟基和6-溴取代基的BT2产生的化学位移变化最为明显。
然后作者测定了BT2与NAD1 SET结构域的亲和力,Kd值为10.4um。除此以外,BT2对NSD蛋白酶的IC50为66μM。因为这个BT2的分子比较小,且配体对NSD1的结合效率较高,所以将其作为先导化合物进行优化。
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作者在结晶NSD1与BT2的复合物失败了。作者仅确定了NSD1 SET域的结构,它这个结构与先前报道的类似(这边的图是他们结晶的图与报道的结构的叠合构象,图b是一个旋转90度的构象)。 
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为了绘制溶液中BT2与NSD1的结合位点,作者使用了NMR光谱,发现该化合物诱导了位于自动抑制环附近的化学位移扰动。但是这个区域并没有任何的结合口袋(结合口袋NSD1 SET域在表面以黄色显示),这表明BT2与NSD1 SET域的结合会导致自抑制环的重排。
因为BT2可诱导NSD1 SET包括自抑制环中残基的化学位移强烈扰动。所以作者探索了共价抑制的可能。作者偶然发现将这个溴改成硫氰酸酯而合成的BT3与NSD1 SET域共价结合,下面是质谱(MS)的验证结果。
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因此,作者把NSD1 SET域与BT3的共价复合物的晶体结构解出来了。可以清楚地看到BT3与C2062的侧链之间形成了二硫键。其结合通过与L2081和F1996的疏水接触以及定义明确的相互作用网络(包括四个氢键)而得以稳定。噻唑环中的硫与N2065和G2066的羰基紧密接触,表明硫族元素成键有利。
作者推测可能是因为存在还原剂导致共价结合。
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从结晶的结果发现配体结合在NSD1 SET域中不存在的自抑制环附近的内部通道样口袋中。此口袋形成于环残基2064-2067和SET域的C末端(残基2081-2083)的重排上,可能与BT3造成N2065的移位有关。
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接下来,作者对BT3进行了结构改造。因为从晶体结构来看,NSD1中C2062可以被亲电子基团靶向从而开发共价抑制剂。所以作者首先引入丙烯酰胺迈克尔受体部分合成了化合物(9)和(10), 通过使用MS和NMR,发现这两种化合物都不能共价结合,仅与NSD1产生弱相互作用。这表明丙烯酰胺部分太大且极性太大,无法装入NSD1上的隐蔽结合位点。
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所以接下来引入了氮丙啶部分,该部分相对较小,疏水且先前已经有关于该集团与半胱氨酸反应的报道。所以得到了BT4(11),经MS测定,它与NSD1共价结合,并在NSD1(包括C2062)相应的位置产生强烈的化学位移扰动。除此以外,作者还开发了两个BT4的类似物,分别加了一个甲基和一个乙基。  发现BT5与NSD1的共价结合速度比BT4快。而BT6不能显示出共价结合,表明较大的乙基减少了与SET结构域的结合。
然后这里,作者对BT5的复合物结晶又失败了,所以用NMR证实BT5与BT3可诱导相同残基的化学位移扰动,包括C2062。为了进一步验证NSD1 SET域中的目标半胱氨酸,作者引入了C2062A的点突变,并发现它消除了BT5的共价结合。
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因为C2062在NSD家族成员中是保守的,所以作者通过测试BT5是否会与NSD2和NSD3 SET域的共价结合来评估BT5的选择性。发现BT5与NSD3孵育8小时会导致14%的共价结合,在18小时后增加至33%。除此以外,BT5不能与NSD2的共价结合。

这些结果进一步表明了BT5的选择性
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后续关于进一步证明BT5选择性的内容就不放了,有兴趣的读者可自行查看原文

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