数字PCR如何实现无内参基因的尿液外泌体miRNA定量检测

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题目

与qPCR相比数字PCR更好地检测尿液中外泌体miRNA 、

摘要

目的:对尿中miRNAs的定量分析具有很大挑战性,尤其是对于低丰度miRNAs定量。本文的目的是实现尿液中外体miRNAs的定量,并比较数字PCR(dPCR)和实时定量PCR(qPCR)的效率。

方法:对dPCR的退火温度、退火时间、PCR循环次数等参数进行优化。我们还比较了dPCR和qPCR的性能。

结果:数字PCR测定尿液中外泌体miRNAs的最佳退火温度为59℃,退火时间为60s,最适循环数为45个。dPCR与qPCR相比具有更高的技术敏感性。dPCR检测miR29a的最低检出浓度为<50拷贝/μL(尿液),而qPCR的最低检测浓度为6473拷贝/μL(尿液)。此外,与qPCR相比,dPCR对连续稀释样品产生了更为一致的结果。dPCR产生的批内变异比qPCR小,但没有达到统计学意义。它还导致了更好的重复性和较小的运行之间的变化。

结论:尿液中外泌体miRNA-dPCR方法的优化依赖于实验退火温度和时间以及PCR循环次数等关键变量的评估。与qPCR相比,dPCR具有更高的灵敏度、重复性和准确性。

背景

1.外泌体40-100nm的囊泡小体,可以从体液中分离出外泌体,比如血浆、尿液、唾液、痰液等样品。也可以从培养的细胞培养基中分离获得。外泌体的主要功能是作为细胞间的信使传递信号,成分包括膜蛋白受体、免疫球蛋白、核酸等物质。目前外泌体中鉴定的核酸包括mRNA、miRNA和其他非编码RNA(ncRNA)。 

2.大量研究表明miRNA可作为早期筛查的分子标志物,如miRNA1290和miRNA375可以作为前列腺癌的早期筛查分子标志物。

3.目前分子定量技术主要是qPCR,qPCR技术也可以实现miRNA的相对定量。但是尿液中miRNA的检测线较低,qPCR技术很难实现;并且qPCR检测miRNA表达,需要用内参作为参考,而尿液中miRNA缺少参考基因,很难准确实现定量;

实验结果

1. 退火温度、退火时间和PCR扩增循环数影响阳性信号和背景信号

图中蓝色和绿色为阳性信号,黑色为背景信号。酒红色的cut off线为区分阳性和背景信号的阈值线。

A,梯度退火发现,随着退火温度的降低阳性信号可以和背景信号分开,但是退火温度过低会导致PCR特异性降低,最后选择了退火温度为59℃。

B-E,退火时间和循环数试验。随着循环数的增大,荧光信号变强,阳性信号和背景信号分开。为了防止突变的产生,退火时间越短越好,最后选择了退火60s和45个循环。推荐的PCR扩增的升降温速率为2℃/s

2. 探针浓度影响阳性信号和背景信号的分离

通过提高探针浓度,发现绿色的阳性信号会和黑色的背景信号分开,防止对结果的误判。

3. dPCR与qPCR相关性比较

A, 比较qPCR和dPCR检测外泌体miRNA表达,qPCR只能检测出表达较高的miR-30c和miR-652,qPCR并不能检测出低水平的miR-29a。相反,dPCR除了可以检测出较高表达的miR-30c和miR-652之外,还可以检测出低水平的miR-29a。

B,miR-652预测值分别与dPCR,qPCR做相关分析,发现dPCR相关性更高。

4.数字PCR与qPCR稳定性比价

通过比较dPCR与qPCR检测miR-30c与miR-652结果,实验结果表明数字PCR的CV值更低,说明数据重复性更好。

结论

1.目前分子定量技术主要是qPCR,qPCR技术也可以实现miRNA的相对定量。但是尿液中miRNA的检测线较低,qPCR技术很难实现;并且qPCR检测miRNA表达,需要用内参作为参考,而尿液中miRNA缺少参考基因,很难准确实现定量。数字PCR不需要参考基因可以实现miRNA的绝对定量;数字PCR更适合尿液中检测低含量的外泌体miRNA。

2.数字PCR与qPCR相比,CV值小,数据重复性好;qPCR在定量时,会受时间节点的影响,导致检测结果不同,数字PCR不会因为时间节点的不同,导致检测结果不同。数字PCR的数据稳定性有保证。

参考文献

Droplet digital PCR improves urinary exosomal miRNAdetection compared to real-time PCR


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