【生信文献200篇】03 TET2突变是如何引起超甲基化

00 文章简介

英文标题:Acetylation Enhances TET2 Function in Protecting against Abnormal DNA Methylation during Oxidative Stress

中文标题:乙酰化增强了TET2在氧化应激中保护异常DNA甲基化的功能

期刊:Molecular Cell

影响因子:14.714    发表时间:2017-01-19

研究领域:甲基化

DOI号:10.1016/j.molcel.2016.12.013

01 文献概括

TETs通过将5mC转化为5hmC,激活DNA去甲基化,并且TET2功能障碍在癌症中经常发生。Zhang等人定义了一种TET2-DNMTs“阴阳”复合物,它在氧化应激期间靶向染色质,以防止异常的DNA甲基化,并识别一种促进这一过程的翻译后修饰。

02 研究背景

TET蛋白通过碱基翻转机制(base-flipping mechanical)将5mC氧化为5hmC,随后形成5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。后两种标记可被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG)切除,并通过碱基切除修复(BER)途径恢复到未修饰的胞嘧啶。此外,5mC转换为5hmC可以通过干扰DNAm维持过程触发被动的、依赖于DNA复制的DNA去甲基化。

在血液恶性肿瘤中TET2经常发生突变,携带TET2突变的患者通常显示整体5hmC水平显著降低。在许多实体肿瘤中也观察到5hmC的丢失,而很少检测到TET2突变,这说明可能存在其他TET2失活机制。

TET2突变,或者全局的5hmC水平下降,是如何导致启动子区域的CG岛的甲基化水平上升的呢?作者猜想 oxidative stress (OS) 在其中起了关键的作用。

     03 实验数据

作者联合表达量和甲基化进行分析:
  • GSE81426

    Genome wide DNA methylation profiling of A2780 cells

    • untreated (mock)

    • treated with H2O2 for 30 min (H2O2 30 min)

    • treated with H2O2 for 30 min with additional 2.5 hour resting (H2O2 3h) .

  • GSE81427

    Genome wide DNA methylation profiling of A2780 cells

    • 1) infected with control virus, no H2O2 (Scr_mock),

    • 2) infected with control virus with H2O2 treatment (30 min plus 2.5 h resting) (Scr_H2O2),

    • 3) infected with shTET2 virus, no H2O2 (shTET2_mock)

    • 4) infected with shTET2 virus, with H2O2 treatment (30 min plus 2.5 h resting) (shTET2_H2O2, two biological replicates).

  • GSE79808

    Transcriptional profiling of A2780 cells with genetic TET2 knockout, generated by CRISPR.

    • Expression profiles of three TET2 KO clones were compared against those of two control clones prepared in parallel.

  • GSE83750

    Genome wide DNA methylation profilings (Bisulfite (BS), or oxidative bisulfite (oxBS)) were done for A2780 cells

    • 1) infected with control virus, no H2O2 (Scr_mock) treatment,

    • 2) infected with control virus with H2O2 treatment (30 min plus 2.5 h resting) (Scr_H2O2),

    • 3) infected with shTET2 virus, with H2O2 treatment (30 min plus 2.5 h resting) (shTET2_H2O2).

  • GSE83751

    obtain DNA methylation profiles across approximately 450,000 CpGs

    • A2780 control cells (Scr 1 and Scr 2)

    • A2780 TET2 KO clones (KO1.1, KO1.36, and KO2.32)

04 研究结果

1

TET2 Is Acetylated by p300

研究了内源性TET2在卵巢癌细胞株A2780和结直肠癌细胞株HCT116中的表达情况(图S1A-C),并进行了TET2抗体检测(图S1D-E),证实了其特异性。

通过免疫印迹分析(IB),发现在内源性TET2和p300之间存在交互作用(图1A)。胰岛素治疗后内源性TET2的乙酰化水平增加4倍以上(图B),并通过PI3K/Akt通路刺激内源性p300乙酰转移酶活性。相反,抑制p300会完全破坏TET2乙酰化(图1C)。

(A)IgG作为阴性对照。全细胞提取物(WCE)作为Input。

共表达p300或CBP可增强异位TET2的乙酰化,但不增强TIP60或MOF(图1D),且依赖于它们的乙酰转移酶活性(图1E)。

此外,所有三个TETs都可以被p300乙酰化(图S1F),表明乙酰化可能代表了该蛋白家族的一般调控机制。

对与p300共表达的外源性TET2进行初始质谱分析,发现有多个乙酰化位点,包括TET2 N端两个进化保守的赖氨酸残基110和111(图S1-J和图S1-G)。将其敲除则完全破坏了p300介导的TET2乙酰化(图1F和S1H)。进一步的质谱分析显示赖氨酸110在内源性TET2蛋白上发生乙酰化,而p300基因敲除后乙酰化减弱(图1F、1G和S1K)。三种重组TET蛋白的全长均比其c端催化结构域具有更高的酶活性,表明n端结构域可能包含正调控机制。另外两个赖氨酸也被确定为真正的乙酰化位点,但它们不影响全长TET2的催化活性,因此没有进一步研究。

2

Deacetylation of TET2 by HDAC1/2

分别用trichostatin A (TSA)或烟酰胺(NAM)、I类、II类、IV类HDAC和II类辅助性SIRT抑制剂处理A2780细胞,发现前者以剂量依赖的方式增加内源性TET2乙酰化,而后者没有(图2A和2B)。HCT116中也观察到TSA诱导内源性TET2乙酰化(图2A),这是另一个TET2表达水平较高的细胞系(图S1A),提示TET2乙酰化可能是一种普遍现象。

在各种HDACs中,HDAC1/2/3主要定位于细胞核,对TSA最敏感。与TET2/p300共表达的HDAC1或HDAC2完全破坏了TET2乙酰化,而HDAC3的影响则小得多(图2C)。

HDAC1和HDAC2都与TET2相互作用(图2D),敲除其中任何一个都会增加内源性TET2乙酰化(图2E)。因此,HDAC1/2是主要的TET2脱乙酰酶。

3

Acetylation Enhances TET2 Enzymatic Activity

上述TSA短暂处理6小时后发现,除了有诱导内源性TET2乙酰化(图2A和2B),还显著提高整体5hmC水平,而不影响TET2蛋白水平(图3A)。同样,抑制HDAC1或HDAC2也会增加5hmC水平(图3B)。

将免疫沉淀的TET2蛋白与纯化的p300催化结构域预培育,可以同时增强TET2乙酰化和催化活性(图3C)。
同样,在乙酰辅酶a存在的情况下,用p300催化结构域孵卵纯化重组TET2可增加TET2乙酰化和生成5hmC(图3D和S3A)。

与野生型(非催化失活突变体)共表达的p300与TET2共表达,随着TET2乙酰化的增加,整体5hmC水平增加了3倍(图S3B)。
野生型TET2过表达显著提高了整体5hmC水平,并引发DNA去甲基化,而阻断TET2乙酰化的2KR突变体(图1F)产生的5hmC/DNA去甲基化明显减少,p300不再能够激活(图3E和S3C)。

综上所述,这些数据表明TET2的乙酰化增强了其酶活性。

4

Acetylation Stabilizes TET2 Protein by Inhibiting Ubiquitination

使用免疫荧光评估不同PDX队列中EGFR的表达,发现EGFR表达有异质性也有发现表达均一性(图4A-C)。免疫荧光检测的EGFR的平均表达强度与肿瘤免疫印迹定量显著相关(图4D)。在PDX组中,EGFR异质性与对吉非替尼的敏感性增加相关(图4E)。

同样,使用p300选择性抑制剂阻断p300乙酰转移酶活性,保持p300蛋白完整,也会以剂量依赖的方式降低TET2蛋白水平(图4B)。此外,TSA处理在6小时内迅速增加了内源性TET2乙酰化,显著延长了TET2的半衰期(图4C和9小时及其后)。相比之下,2KR突变体的稳定性明显不如野生型蛋白(图4D),这表明乙酰化可以稳定TET2。

此前有报道称TET蛋白的稳定性可能受到半胱天冬酶和calpain介导的降解途径的调控。
作者发现在所研究的细胞中,TET2被蛋白酶体抑制剂MG132稳定,而没有被calpain或caspase抑制剂稳定(图4E),并且在MG132处理后,保守的双链-螺旋结构(DSBH)结构域的蛋白积累最为显著(图4F和4G)。

这些发现表明TET2蛋白可能主要通过泛素-蛋白酶体途径调控,泛素化位点可能位于c端DSBH区域。

作者检测到TET2泛素化,MG132处理后TET2泛素化增强(图4H,列1、2、3)。TSA处理在增加TET2乙酰化的同时(图2A和2B),显著降低TET2泛素化(图4H,列3和列4)。

相反,乙酰化缺失的2KR突变体比野生型表现出更强的泛素化(图4I,列2和列5),TSA处理后,其抗泛素化降低(图4I,列5和列6,与列2和列3相比)。

由于泛素化位点位于c端DSBH结构域(图4G),而调控乙酰化位点K110位于N端,数据表明,乙酰化可能通过招募其他蛋白来稳定TET2,进而保护远端赖氨酸免受泛素化位点的影响。

5

TET2 Acetylation Enhances DNMT1 Binding to Promote Protein Stability

在急性DNMT1基因敲除时,TET2蛋白减少甚至丢失(图5A、S5A和S5B):

此外,内源性TET2和DNMT1以TET2酶活性无关的方式相互作用(图5B)(图S5C)。

使用免疫沉淀TET2和纯化重组DNMT1,也很容易检测到这两个蛋白之间的直接结合(图5C)。

作者进一步确定,已知能与多种蛋白相互作用的DNMT1 n端调控域单独与TET2相互作用(图5D),而含有K110/111残基的TET2 N1区域与DNMT1的关联最强(图5E)。

缺失K110/111的TET2 N1区域缺失突变体与DNMT1的相关性严重降低(图5F),表明这两种赖氨酸在介导DNMT1相互作用中起重要作用。

有趣的是,TSA处理细胞可增加TET2乙酰化(图2A和2B)和蛋白稳定性(图4C),增强内源性TET2和DNMT1之间的相互作用(图5G)。

相比之下,乙酰化缺失的2KR突变体将这种相互作用降低了约70%(图5H和S5D)。TET2 2KQ突变体通过中和正电荷而模拟组成乙酰化状态,但避免了乙酰化,也降低了DNMT1的结合(图5H)。

这一发现表明,乙酰化本身可能促进了DNMT1和TET2之间的相互作用。最后,DNMT1结合似乎对TET2稳定性至关重要,因为在感染了DNMT1 CRISPR病毒的细胞中,TET2蛋白的半衰期显著降低(图5J)(图5I)。

数据表明,TET2的乙酰化增强了DNMT1的结合并促进了其稳定性。

最后,作者发现所有三个TETs都与主要的维护甲基转移酶DNMT1相互作用(图S5E),而且TET2不仅与DNMT1相关联,而且还与从头甲基转移酶DNMT3B相关联(图5K和S5F)。

这些发现表明了TETs和DNMTs之间的一般关系以及这些TETs/DNMTs复合物的潜在功能相关性。

6

Targeting of TET2 to Chromatin during OS to Protect against Abnormal DNAm

在双链断裂(DSB)修复过程中,特别是在暴露于活性氧(ROS)后,可能会发生异常的甲基化。在此过程中,由DNA修复蛋白引发的蛋白复合物(具有与TET2、DNMTs相对应的活性)快速向CGIs转移。5hmC存在于DNA损伤位点,而TETs的缺失会损害DNA损伤修复。将这些过程联系在一起,证明了TET2和TDG(完成由TET2启动的最后去甲基化步骤所需的蛋白质)以一种受TET2乙酰化影响的方式参与了这些DNMT复合物。在OS过程中,TET2对正常未甲基化启动子CGIs和增强子上的癌症特异性异常DNAm具有功能保护作用。

首先,在DNA损伤方面,将A2780细胞暴露于过氧化氢(H2O2) 30分钟后,会增加总体的γ-H2AX蛋白水平,并诱导γ-H2AX焦点的形成(图S6A),DNMT1和DNMT3B、TET2和TDG与染色质紧密的结合(图6A和S6B)。

TDG和TET2之间的直接联系证实了TDG参与复合物(图6B和6C),通过识别TET2与TDG相互作用的区域进一步证实(图S6C)。这种相互作用不依赖于TET2乙酰化(图S6D),但被OS增强(图S6E),且在三种TET蛋白中均保守(图S6F)。

OS主要诱导TET2/TDG通过DNMT1进入染色质,但不影响TET2和DNMT1/DNMT3B之间的相互作用(图6D-E)。并且DNMT3B不是TET2靶向染色质所必需的(图S6G)。

单独使用H2O2处理显著增加了DNMT1/TET2/TDG与染色质的结合,通过共表达p300,染色质结合的TET2和TDG的数量进一步增加,促进TET2乙酰化(图6F)。优化了转染条件,使所有样品中都产生了等量的TET2蛋白(图S6H)。

虽然野生型TET2和TDG在处理后与染色质结合更紧密,但2KR突变体显著降低了这两种蛋白的浓缩(图6G)。但,DNMT1的紧收在两种情况下都没有受到影响,说明TET2/TDG靶向性的增加/降低,与TET2乙酰化相关,归因于TET2和DNMT1之间的增强/降低的关联 (图5G和5H)。因此,通过增强与DNMT1的关联,TET2乙酰化正向调节其在OS期间对染色质的收紧。

数据分析

通过CRISPR / Cas9技术将该蛋白在A2780细胞中完全破坏,从而产生了单个选定的克隆,其总体5hmC水平显著降低,并且三个DNMT的水平未发生变化 (图7A)。

在所有三个TET2 KO克隆中,不仅获得了主要的全球 DNAm (图S7A),而且一些获得是专门针对低基础表达基因(CGILE)的正常未甲基化启动子CGIs (基底b < 0.25) 的探针子集 (图7B和S7B) 。具有中间基础甲基化水平的LE启动子CGIs探针(0.25 < b < 0.75)也可以看到增益(图7B)。这些基因通常在胚胎干细胞(ESCs)和成人干细胞中以二价染色质标记,它们在癌症中最有可能获得从头开始的启动子CGI高甲基化。

在TET2 KO克隆中具有DNAm增益的探针中(图7C),40.4%的靶基因被ESC中的二价染色质标记(图7D)。共459个基因,其中2价基因232个(50.5%)在 TET2 KO 克隆中获得甲基化,在各种癌症类型中也常发生高甲基化(图7D;表S1) 。这些基因在ESCs中对二价染色质起作用的生物功能中也显著丰富,如发育、分化和转录调节(图7E)。启动子CGIs的高甲基化与相关基因的下调相关(图7F),说明了TET2 KO诱导的异常DNAm。

与启动子探针相似的是,在现有的TET2 KO中,一组具有低和中等基础甲基化水平的增强子探针得到了DNAm(图7G和S7C),而一组高甲基化增强子功能性地抑制了它们假定的靶基因的表达(图7H)。

之后作者确认了这些增强器结果的潜在的生物意义(图S7D)。

TET2靶向染色质,通过与DNMT1的相互作用,去除不需要的DNAm。在TET2野生型细胞中,H2O2处理30min,在30 min和2.5 h后(3 h)检测DNAm(图S7E),在后一个时间点DNAm整体增加(图S7F)。

全基因组水平:即 OS 诱导的染色质上的 DNMTs 收紧导致 DNAm 增加。

同样,在低表达基因的启动子CGIs以及低甲基化和中甲基化增强子探针中也可以看到异常的收获 (图S7G-S7I) 。此外,TET2 野生型细胞 OS 过程中获得的大部分启动子 CGIs 和增强子探针在 TET2 KO 克隆中也高甲基化 (图S7J和S7K) ,提示 TET2 可能通过类似途径在 KO 和 OS 诱导的情况下保护异常 DNAm。

在评估5mC水平的同时检测5hmC水平,定义TET2在上述OS模型中防止异常DNAm的作用。

① 整体 5hmC 水平的升高与 H2O2 处理后3小时时间点异常 DNAm 的增加相吻合(图S7L),即 TET2 正积极地将5mC 转化为 5hmC 。

② shRNA 急性耗尽 TET2 ,其本身在短时间内对整体 DNAm 的影响最小,显著降低整体 5hmC 水平(图S7M-N),当与H2O2处理(双处理)联合使用时,可产生更大的 DNAm 。

③ 允许通过Infinium 450K assay同时评估5mc和5hmc,确认在OS期间异常高甲基化的低表达启动子CGIs探针组,在双重处理下5mC升高,同时5hmC降低。并且 vulnerable enhancers 组有同样的趋势。(图7K,L)

④ 在TET2 KO克隆中,高甲基化的启动子CGI和增强子探针在OS期间也容易获得异常的DNAm,并且在TET2耗尽时,在OS诱导过程中会进一步获得DNAm(图S7Q和S7R)。

以上结果进一步说明了TET2在上述OS导致的异常DNAm保护中的重要作用。

05 关键结论

  • We now demonstrate TET2 forms ‘‘Yin-Yang’’ complexes with DNMTs and is targeted to chromatin during OS.

  • TET2 actively removes abnormal DNAm induced by OS in promoter CGIs as well as enhancers by converting unwanted 5mC to 5hmC.

  • Long-term reduction of TET2 caused even more DNA hypermethylation on these gene promoters and enhancers.

06 问题

1. 免疫印迹结果图解

2. 所涉及的全基因组DNAm分析流程

  1. 下载原始数据(IDAT files),

  2. 使用the minifi Bioconductor 包处理原始;

  3. SWAN包进行数据标准化;

  4. 数据筛选:

    • 将甲基化探针和未甲基化探针信号之和作为甲基化探针信号的值计算。不考虑信号差的探针(检测p值>0.01)。

    • 计算5hmC值

  1. Limma包进行数据处理,提取mock channel,按照log2(intensity)排序。

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