JMC | 选择性Janus激酶2(JAK2)假激酶配体的发现与设计

作者:石诚

来源:大科研小分享(Ai_Fen_Xiang2020)

文章介绍
大家好!今天给大家分享的是2020年四月份发表在JMC上面的一篇文章,这篇文章的通讯单位为耶鲁大学,主要讲述的是一个具有二氨基三唑核心的选择性Janus激酶2(JAK2)假激酶配体的发现与设计
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Janus激酶
以下背景源自搜狐新闻报道的由中山大学附属第一医院杨念生教授发表的演讲:
《新通路:JAK抑制剂的发现和药物开发之路》
https://www.sohu.com/a/335715310_377336
JAK的名字来自罗马神话中的天门神Janus。Janus早晨打开天门,让阳光普照人间,晚上又把天门关上,黑暗降临大地。由于Janus前后各有一副面孔,一面看过去,一面看未来,因此也被称为两面神或时间之神。
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子图来源:https://www.sohu.com/a/335715310_377336
和Janus一样,JAK也拥有“两面”:它有两个几乎相同的磷酸转移域,一个结构域显示激酶活性(JH1),而另一个结构域没有激酶活性,主要负责调控第一个结构域的激酶活性(JH2假激结构域)。JAK的作用同样具有双面性。一方面,JAK为免疫反应所必需的通路,另一方面,在炎症发生发展的过程中,JAK可能过度激活,导致疾病进一步发展。
JAK家族共包括JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2四种蛋白,传导的信号也各不相同。JAK1、JAK3更多地负责免疫调节,而JAK2则主要与红细胞和血小板的生成相关。
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文章背景
有研究表明JAK2中JH2结构域上的单点突变Val17Phe可引起大多骨髓增生异常性疾病,包括真性红细胞增多症,骨髓纤维化和原发性血小板增多症。V617F突变是一种激活突变,导致激酶活性增加。
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另一方面,当抑制野生型JAK2. JH1域时会产生诸如贫血和血小板减少等不良副作用。因此,选择性抑制V617F JAK2具有治疗价值。
又有报道表明,突变JH2上与ATP结合的氨基酸残基可以将野生型JAK2的自磷酸化提高2-5倍,而它们通常将V617F JAK2的活性降低5-15倍(达到我们想要的结果)。因此这项工作探索了这么一个通过阻断ATP与JAK2 JH2 的结合而选择性逆转V617F突变激活作用的可能性。
设计过程
为了检验上述假设,作者的首要目标是发现可以与JAK2 JH2的ATP结合位点牢固结合但与JAK2 JH1的ATP结合位点最弱结合的小分子。下一步是测试对全长野生型和V617F JAK2的自磷酸化活性的影响。
先导化合物的发现
首先,作者通过在荧光偏振(FP)分析中进行高通量筛选发现了可与JH2 ATP结合位点结合最强的分子(已知的pan-CDK和pan-JAK抑制剂JNJ7706621(以下称之为化合物1)
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随后通过等温滴定热分析(ITC)进行分析,得出与这个化合物对JAK2 JH2和JH1的结合常数Kd分别为106和31 nM。
确定的JAK2 JH2和JH1与1的晶体结构表明。1与JH2和JH1的结合位置相似,均位于铰链区和且二氟苯基取代基走向一致。在这两种情况下,1的二氨基三唑片段均与相关的氨基酸产生三个氢键相互作用。
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为了寻找可能与JAK2 JH2中的ATP位点选择性结合的分子并避免抑制野生型(WT)JAK2的激酶活性。接下来作者保留化合物1中选择1中3,5-二氨基-1,2,4-三唑的结构然后进行了衍生
从化合物1与JH2和JH1的结合可以很明显的发现所需的选择性需要利用JAK2 JH2中朝向Thr555和Arg715的结合裂隙的空置东部的差异。 
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但是,这个区域是ATP的三磷酸与JH2的结合区域。如图3所示。因此,这是一个非常极性的区域,由于设想的极性取代基在水和极性结合位点中已被很好地溶解,因此存在靶向困难。
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然而在后续的研究中,作者还是认为在分子结尾添加的相对刚性的极性取代基模拟磷酸根的阴离子可能是有效的。
除此以外,作者也考虑了这种方式可能与ATP竞争。因为ATP与WT JAK2 JH2和V617F突变体的结合常数都相对较低,结合常数为1.3μM,因此也没有太大的影响。
导化合物的优化
接下来,文章介绍的就是这一系列化合物的整个优化过程。文中提到的第一个问题是1中羰基与JAK2 JH2结合的重要性。尽管羰基氧原子与Lys581的铵基团存在氢键),但它与Gln626的侧链羰基氧原子会与它产生一个排斥。
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这样制得1的脱氧类似物2。在FP分析中发现2的Kd为16.7μM,与JAK2 JH2的亲和力大大降低。显然,带电荷铵基团的氢键足以抵消Gln626的排斥作用,并且刚性增加是有益的。
确定了羰基的合理性后,下一步是添加一个取代基,该取代基应从Lys581朝着Thr555向东伸出,朝着Thr555,而不是从结合位点向外伸出。因为N-苯基取代基可能与Lys581形成阳离子-π相互作用,所以作者先改了这个苯取代基的部分。
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同时修改了这个氨磺酰基的部分。该概念导致3和4的合成。由于氰基类似物的溶解度较小,所以3的活性没有测。而4的结果比2提高了3倍。晶体结构清楚地显示了所需的向东投影以及与Lys581的阳离子-π相互作用。除此以外4的结合模式与1基本相同。
为了进一步提高4的活性,接着合成了5,相当于4的叔甲基酰胺。从理论上看4中酰胺NH的H键合在一个水分子上效果与5中的叔甲基类似,因此看起来4和5的Kd值相似。但实际测定时5的活性要差得多。
作者这里该处的解释是乙苯胺偏爱Z-构型,而N-甲基乙苯胺偏爱E-构型。假设这种偏好延续到4和5,则对于5而言,要实现与Lys581进行阳离子-π相互作用所需的Z构象,将产生显着的构象损失。
还考虑了吡啶基取代基6和7。在这里作者并没有结晶,而是采用了计算的方法初始的复合物结构,发现吡啶基氮原子与Lys581的可能发生N-N相互作用。
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然而实际实验测定的活性比4差很多。作者考虑可能还是因为分子间和分子内能量学和溶剂化的复杂性,造成的这种预测结果与实际结果的差异。
除此以外也考虑了化合物4苯环对位的取代基,该取代基将进一步延伸至Thr555和Arg715(图4)。
考虑到ATP的末端磷酸酯在该区域中的位置,作者分子末端终止于阴离子基团的取代基比较好。然后通过计算确认了羧基甲氧基的潜力。 
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与苯甲醚一样,OCH2片段应与苯环在同一平面内,并且羧基应与Thr555延伸形成氢键。然后为了进行比较,同步合成了羧酸和酯。
经实验测定, 与4相比,新合成的化合物活性达到了巨大的改善。证实了阴离子末端对取代基的重要性。
然后作者又做了9和10与JAK2 JH2的晶体结构。如图6所示,10的羧酸根基团如预期的那样延伸, 它的位置与图3中ATP的末端磷酸酯基团相似,并且与Thr555的主链NH和侧链OH形成氢键。
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除此以外,羧酸盐基团与晶体结构中局部水分子产生广泛的氢键作用网络。紧接着,作者在观察10的晶体结构时,认为羧酸基团向Arg715的额外延伸1Å以形成盐桥可能对结合和选择性都有利。
然后合成了12,FP分析结果为0.346±0.034μM,结晶结果也如之前作者所预测的那样,表明了设计的有效性。作者也合成了一些其他的五元杂环,结果比12弱一些。
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除了这些结构以外,作者还合成了一个(E)-肉桂酸类似物15,用乙烯基取代了OCH2接头,Kd为0.37μM。这种改善的原因可能在于15有更大刚性,从而消除了一个扭转自由度所致。
关于后面的实验内容在此省略,感兴趣的可自行查看原文

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